一种改进型恒温指数扩增技术及其在microRNA检测中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子检测领域，具体涉及一种改进型恒温指数扩增技术及其在 mi croRNA检测中的应用。
【背景技术】
[0002] 恒温指数扩增反应（Isothermal Exponential Amplification Reaction，EXPAR) 技术是由D. J. Galas等在2003年建立起来的一种基于DNA聚合酶和切口酶设计的高效核 酸扩增技术。该技术的原理如图1所示：应用一条中间包含切口酶识别序列，3'端与5'端 序列完全相同的模板，当引物与模板的3'端杂交后，在聚合酶的作用下进行线型扩增。扩 增后，内切酶识别并切割5'端扩增出来的片段，该片段在DNA聚合酶的链置换作用下被释 放出来，进一步与另一条模板的3'端进行杂交和扩增，形成指数形式的扩增。该方法可以 在恒温条件下对短链核酸（10-25碱基）进行高效、快速的指数扩增，一般在几分钟内可对 目标核酸放大1〇 6_1〇9倍。与PCR扩增技术相比，恒温指数扩增方法所需时间短，不需要精 确的热循环装置，其扩增倍数足以与PCR技术媲美。因此，恒温指数扩增反应技术已被广泛 应用于短核酸的检测，特别是对microRNA (miRNA)的定量分析。
[0003] MiRNA是一类对基因表达具有调控作用的非编码小分子RNA( 18-24碱基)。它在动 植物生长、发育、分化和生殖等过程中发挥着重要作用。人类约30%的基因受miRNA调控， 且miRNA的表达水平与人类重大疾病密切相关。对miRNA的定量检测有助于深入理解其作 用机制，对疾病的诊断与治疗以及相关基因药物的开发等具有重要意义。由于miRNA的序 列短，在细胞或者体液内的表达水平非常低、易降解且同源miRNA之间仅相差1-2个碱基， 一般方法难以实现检测。Northern印迹技术是当前分析miRNA的标准方法，但该方法操作 繁琐、耗时长、灵敏度低，分析检测时需要大量的样品及分离富集步骤，且对RNase污染非 常敏感，实验中任何一步操作不当都会影响分析结果。Microarray方法可实现高通量、多 组分miRNA同时检测，但该方法的特异性和灵敏度较低，并且微阵列芯片的制备和检测成 本很高。RT-PCR是灵敏检测miRNA的有效方法，但由于miRNA序列短，不适合直接使用PCR 扩增，需要依赖多种技术先将miRNA转录成cDNA再进行扩增，导致方法操作复杂，耗时长； 另外该方法需要精确的控温仪器，增加测定成本。恒温扩增检测miRNA的方法如滚环扩增 (RCA)、线性扩增、指数扩增(EXPAR)等由于能在恒温条件下获得高效的扩增，成为研究和应 用热点。
【发明内容】
[0004] 由于现有的恒温指数扩增反应中的扩增模板的5'端和3'端的序列完全相同，弓丨 物在两端杂交的几率和速率也相同。杂交在3'端的引物能够正常扩增，而杂交在5'端的 引物无法扩增，因此，常规的恒温指数扩增反应损失了 50%的扩增效率。本发明通过对现有 指数扩增技术进行改进，抑制引物在扩增模板5'端的杂交，从而提高恒温指数扩增反应的 扩增效率，目标建立一种更为快速、高效和灵敏的恒温指数扩增技术并应用于短链核酸的 灵敏检测。
[0005] 本发明所采取的技术方案是： 一种改进型恒温指数扩增模板，其包括3'端序列、5'端序列，以及3'端序列和5'端 序列之间的切口酶识别序列；所述3'端序列和5'端序列相同，均与待检核酸序列互补；5' 端序列至少有一个碱基上修饰有biotin。
[0006] 进一步地，优选在5'端序列l-10bp的至少一个碱基上修饰biotin。
[0007] 更进一步地，优选在5'端序列第2个碱基上修饰biotin。
[0008] -种用于检测miRNA let_7a的恒温指数扩增模板，其序列为： 5'-AACTATACAACCTACTACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTACTACCTCAA-3'，其第 1-23 bp 至少有一个碱基修饰有biotin。
[0009] 进一步地，优选在其序列的第1-10 bp的至少一个碱基上修饰biotin。
[0010] 更进一步地，优选在5'端序列第2个碱基上修饰biotin。
[0011] -种改进型恒温指数扩增试剂盒，其包括： (1) 恒温指数扩增模板； (2) DNA聚合酶； (3) 内切酶； (4) 链酶亲和素。
[0012] 进一步优选地，所述试剂盒中还包括：dNTP、SYBR Green I荧光染料、酶缓冲液。
[0013] 一种改进型恒温指数扩增技术，包括如下步骤： (1) 将恒温指数扩增模板、dNTP、RNase抑制剂、待检样品和链酶亲和素混合制成A反应 液； (2) 将DNA聚合酶、内切酶、SYBR Green I荧光染料混合制成B反应液； (3) 将A反应液和B反应液混合后进行指数扩增反应； (4) PCR仪上监控扩增曲线，求得P0I值，根据建立的标准曲线求得目标核酸序列的浓 度。
[0014] 指数扩增反应体系含有：0. 5XNt. BstNBI缓冲液、0. 1 y M恒温指数扩增模板、250 yMdNTP、0. 8 U/yL RNase抑制剂、待检样品、0. 2 yM链酶亲和素SA、lXThermoPol聚合酶 缓冲溶液、0.05 U/yL Vent(exo-)聚合酶、0.4 U/yL 切 口酶、0.4XSYBR Green I 荧光染 料、DEPC水；所述0? 5XNt. BstNBI 缓冲液含有：25 mMtris-HCl, pH 7. 90, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl, 0. 5 mM EDTA ;所述 lXThermoPol 聚合酶缓冲溶液含有：10mMKCl，10 mM (NH4)2S04, 20 mMTris-HCl pH 8.8,2 mM MgS04,0. 1% Triton X-100〇
[0015]本发明的技术原理为： 根据待测miRNA序列设计扩增模板(如图2所示)。该模板包含三段序列：序列1和序 列3完全相同，且与目标miRNA序列互补；序列2为切口酶的识别序列；另外：在靠近模板 5'端的碱基上修饰一个生物素（biotin)，当溶液中加入链霉亲和素（SA)时，SA与biotin 结合可使扩增模板5'端的Tm值降低，在恒温指数扩增条件下，能提高目标miRNA序列与模 板3'端的结合效率，同时加速被切口酶剪切后的DNA片段从模板5'端离去的速度，从而提 高了指数扩增技术的扩增效率与灵敏度。其具体步骤如图3所示。
[0016] 本发明的有益效果是： 本发明通过在常规指数扩增模板的5'端与引物互补的区域内的一碱基上修饰一生物 素来调节引物与扩增模板3'端和5'端的杂交速度，建立了改进型恒温指数扩增方法。该 方法较常规恒温指数扩增方法，具有以下优点： 1、 扩增效率更高，速度更快，缩短分析时间； 2、 标准曲线的线性范围更宽，特异性更好，灵敏度更高； 3、 方法具有很好的精确性，重复性和稳定性，可发展成为试剂盒并向市场推广。
【附图说明】
[0017] 图1为恒温指数扩增反应原理图。
[0018] 图2为改进型恒温指数扩增方法模板设计示意图。
[0019] 图3为改进型恒温指数扩增方法示意图。
[0020] 图4为不同位点扩增曲线图。
[0021] 图5为不同聚合酶量（A)和不同内切酶量（B)条件下let_7a扩增反应P0I值与 空白实验P0I值之差；（C) - (F)扩增反应在不同模板量条件下对let_7a和空白的扩增曲 线图。
[0022] 图6为标准曲线图。
[0023] 图7为方法特异性分析图。
【具体实施方式】
[0024] 下面以检测miRNA let-7家族中let_7a为例，对本发明的技术方案作进一步的说 明，但并不局限于此。
[0025] 实施例1 一种用于检测miRNA let_7a的改进型恒温指数扩增模板的设计 miRNA let-7a 的序列为：5'-UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGUU-3'（SEQ ID N0. 1)。
[0026] 根据miRNA let_7a的序列，并以Nt. BstNBI为切口酶设计扩增模板如下： 5'端互补序列切口酶识别序列3'端互补序列 5' -AA (biotin) CTATACAACCTACTACCTCAA - ACAGACTCA - AACTATACAA CCTACTACCTCAA-3' （SEQ ID N0.2) 模板5'端的第二个A碱基上修饰有biotin。
[0027] 实施例2恒温指数扩增方法检测条件的优化 (1)最佳修饰biotin位点的选择 制备不同标记的扩增模板如下： SiteO:5' -AACTATACAACCTACTACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTACTACCTCAA-3' S i te2:5? -AA (b i 〇t in)CTATACAACCTACTACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTACTACCTC AA-3' Site6:5' -AACTAT(biotin)ACAACCTACTACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTACTACCTC