能抑制MAT2A基因表达的siRNA及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及能抑制MAT2A基因表达的SiRNA及其应用。
【背景技术】
[0002] 肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，位居全 国癌症发病率第二位，每年因肝癌死亡的人数约为35万。目前，手术切除和肝移植是治疗 肝癌最有效的方法。但由于早期诊断率低、肝移植供体紧缺等原因，大部分患者失去了根 治性手术的机会，患者5年生存率仅为10-20%。经动脉灌注化疗栓塞（Transarterial chemoembolization，TACE)是不能手术切除肝癌的主要治疗手段，可促进肿瘤缺血性坏死， 抑制其生长，但栓塞难以彻底，术后的复发与转移始终是提高远期疗效的瓶颈；而传统的手 术、放疗、化疗或中药等方法的治疗效果欠佳。因此，寻求新的治疗模式迫在眉睫，而基因治 疗可能是从根本上解决这一难题的希望。
[0003] 肝细胞癌的多种基因出现异常表达，其中MAT基因较为特别。MAT基因可分为 MAT1A基因与MAT2A基因，编码唯一能催化合成S-腺苷蛋氨酸的酶一一腺苷蛋氨酸转移酶 (Methionine adenosyltransferase，MAT)。MAT 有三种同工酶，分别是 MATI、MATIII和 MATII，前两种是 MAT1A (Methionine Adenosyltransferase 1A)基因编码的产物，后一种 是 MAT2A(Methionine Adenosyltransferase 2A)基因编码的产物。MAT1A 基因主要在成 人肝脏中表达，而MAT2A基因在除肝脏以外的人体组织器官中广泛表达。有趣的是，胎肝中 主要表达的是MAT2A，在胎儿出生后逐步被MAT1A取代。在肝癌中MAT2A被诱导重新表达， MAT1A的表达则发生沉默，这种转变为肝癌细胞生长提供有利条件。国内外学者针对MAT基 因已经做了多方面的研究，也取得可喜的成果。Cai等发现，恢复MAT1A表达的Huh-7细胞 内SAMe的含量增加了 52%，而DNA合成速率下降了 20%，肿瘤细胞生长速度减缓了 25% ; 再导入MAT2A反义RNA后，这些作用进一步增强。Li等构建过表达MAT1A的Huh-7稳定表 达细胞株，发现SAMe升高将近3倍，细胞凋亡率升高超过2倍，生长受抑制；体内实验显示， 过表达MAT1A的Huh-7在裸鼠成瘤速率下降约50 %，微血管密度下降40 %，SAMe含量升高 2倍。Liu等应用RNA干扰技术抑制MAT2A的表达，结果显示MAT2A基因的mRNA含量和MAT II活性均降低，细胞凋亡指数接近30 %。这些研究表明，针对MAT基因的干预可明显抑制肝 癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，减缓肿瘤的生长。然而，至今对于MAT1A和MAT2A联合干预 肝癌细胞成瘤的研究仍然较少，尤其是MAT基因的表达失调对肝癌血管生成及侵袭转移是 否有影响，目前尚未见报道。
[0004] RNA干扰（RNA interference，RNAi)是指一些外源性或内源性小双链RNA (small interfering RNA，siRNA)在细胞内根据碱基配对原则与相应的mRNA结合，诱导mRNA降 解，特异性、高效地阻断特定基因的表达，导致细胞出现相应基因表达缺失的技术。Guo等在 1995年将正义链或反义链RNA导入线虫体内，发现其par-1基因表达被特异性抑制了。随 后，Fire等在1998年证实，真正有效地抑制目的基因表达的是双链RNA，从此揭开RNAi的 神秘面纱。RNAi特异性降解同源mRNA，对基因的转录过程无影响，而是影响基因的翻译过 程，因此也称转录后基因沉默。RNAi效率高、特异性强、操作简单等特点，已经成为研究特定 基因功能的常用技术。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种能抑制MAT2A基因表达的siRNA。
[0006] 本发明的能抑制MAT2A基因表达的siRNA，其特征在于，包括siRNA MAT2A-1或 siRNA MAT2A-2 ；
[0007]所述的 siRNA MAT2A-1，其正义链为：5' -GCAACA⑶CACCAGAUAUU-3'（如 SEQ ID NO. 2 所示），其反义链为：5' -AAUAUCUGGUGACUGUUGC-3'（如 SEQ ID NO. 3 所示）；
[0008]所述的 siRNA MAT2A-2,其正义链为：5' -GCCUAUGGCCACUUUGGUA-3'（如 SEQ ID NO. 4 所示），其反义链为：5' -UACCAAAGUGGCCAUAGGC-3'（如 SEQ ID NO. 5 所示）。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种抑制MAT2A基因表达的慢病毒表达载体，其特征 在于，其是将能抑制MAT2A基因表达的siRNA转入慢病毒载体而得到的。
[0010] 所述的载体为慢病毒载体P⑶H-U6。
[0011] 本发明的第三个目的是提供过表达MAT1A基因的慢病毒载体联合抑制MAT2A基因 表达的慢病毒表达载体在制备抑制肝癌药物中的应用，所述的MAT1A基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1的第256位-1443位碱基所示。
[0012] 所述的抑制肝癌的药物是抑制肝癌血管生成、肝癌迀移和侵袭、肝癌肺转移的药 物。
[0013] 过表达MAT1A基因的慢病毒载体优选是将MAT1A基因插入慢病毒载体p⑶H-CMV 的酶切位点EcoR I和BamH I之间而得到的。
[0014] 通过GenBank搜索，获得人源MAT1A的cDNA序列（Gene ID:4143,其序列如SEQ ID NO. 1所示，具体的MAT1A基因如SEQ ID NO. 1的第256位-1443位碱基所示），设计引 物并经PCR扩增cDNA后，使用EcoR I和BamH I进行酶切，再与经过同样酶切的慢病毒载 体pCDH-CMV连接；然后转化感受态大肠杆菌DH5 a进行扩大培养；进行纯化质粒后可得到 表达MAT1A基因的慢病毒载体p⑶H-MAT1A，测序验证其序列的正确性；通过将慢病毒载体 转染SMMC-7721细胞后验证转染后MAT1A基因的mRNA水平显著升高。
[0015] 敲低MAT2A的慢病毒载体是采用siRNA表达载体法来实现的。根据在GenBank 中搜索确定人源MAT2A的mRNA序列（Gene ID:4144)，设计并筛选得到了可有效抑制 SMMC-7721 中 MAT2A 的 mRNA 表达的 siRNA MAT2A-1 和 siRNA MAT2A-2,再合成对应的 siDNA 序列，经PCR扩增后，使用Cal I和BamH I进行酶切，再与经同样酶切的慢病毒载体 p⑶H-U6连接；转化感受态大肠杆菌DH5 a进行扩大培养；纯化质粒后可得到敲低MAT2A的 慢病毒载体P⑶H-sh-MAT2A-l和p⑶H-sh-MAT2A-2,测序验证其序列的正确性；通过将慢病 毒载体转染SMMC-7721细胞后验证转染慢病毒载体pCDH-sh-MAT2A-l和pCDH-sh-MAT2A-2 的SMMC-7721细胞中MAT2A的mRNA水平显著降低。
[0016]将构建好的慢病毒载体 pCDH-MATIA、pCDH-sh-MAT2A-l、pCDH-sh-MAT2A-2 以 及空载体质粒P⑶H-CMV、p⑶H-U6进行慢病毒包装，经过293T细胞扩增，浓缩后得到高 滴度的慢病毒。将已经浓缩回收的5种慢病毒进行重组，得到以下6个组合：p⑶H-CMV/ PCDH-U6 (control)、pCDH-MATlA/pCDH-U6 (MATlA+pCDH)、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-l (pCDH +sh-MAT2A-l)、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-2 (pCDH+sh-MAT2A-2)、pCDH-MATlA/pCDH-sh-MAT 2A-1 (MATlA+sh-MAT2A-l)和 pCDH-MATlA/pCDH-sh-MAT2A-2 (MATlA+sh-MAT2A-2)。根据分 组，将慢病毒组合分别感染SMMC-7721细胞，利用嘌呤霉素筛选出稳定表达细胞株；通过半 定量RT-PCR验证mRNA的表达，利用Western blot检测蛋白表达情况，Western blot检测 结果和RT-PCR的基本保持一致。
[0017] 利用内皮细胞管形成实验证实低表达MAT2A基因、高表达MAT1A基因抑制肝细胞 癌血管生成的能力，两者联合时效果更强。利用小室迀移、小室侵袭和动物实验证实低表达 MAT2A基因联合高表达MAT 1A基因能抑制肝癌血管生成、肝癌迀移和侵袭、肝癌肺转移。
[0018] 本发明的利用siRNA敲低表达MAT2A基因且联合高表达MAT1A基因的用于肝细胞 癌，具有良好的抑制肝癌血管生成、肝癌迀移和侵袭、肝癌肺转移的效果；可进一步将其应 用于肝癌疾病的治疗，具有很高的理论和应用价值。
【附图说明】
[0019] 图1是SMMC-7721细胞转染siRNA后MAT2A的mRNA表达半定量RT-PCR图。以 GAPDH 为内参，siRNA-N、siRNA-c、siRNA-3、siRNA-2 和 siRNA-1 分别代表不转染、转染阴 性对照 siRNA MAT2A-C、转染 siRNA MAT2A-3、转染 siRNA MAT2A-2、转染 siRNA MAT2A-1 的 SMMC-7721 细胞。
[0020] 图2是SMMC-7721细胞转染pCDH-MATIA后MAT1A的mRNA的表达半定量RT-PCR 图。以GAPDH为内参，SMMC-7721、pCDH和pCDH-MATIA分别代表不转染、转染pCDH-CMV空 载体和转染pCDH-MATIA的SMMC-7721细胞。
[0021] 图 3 是 SMMC-7721 细胞转染 pCDH-sh-MAT2A-l 或 pCDH-sh-MAT2A-2 后 MAT2A 的 mRNA 的表达半定量 RT-PCR 图。以 GAPDH 为内参，SMMC-7721、pCDH、sh_MAT2A_l 和sh-MAT2A-2分别代表不转染、转染pCDH-U6空载体、转染pCDH-sh-MAT2A-l和转染 pCDH-sh-MAT2A-2 的 SMMC-7721 细胞。
[0022] 图4是稳定株中MAT1A和MAT2A的mRNA的表达半定量RT-PCR图。以GAPDH为 内参，Control、pCDH+sh-MAT2A-l、pCDH+sh-MAT2A-2、MATlA+pCDH、MATlA+sh-MAT2A-l、 MAT lA+sh-MAT2A-2分别代表转染的质粒载体类型为pCDH-CMV/pCDH-U6、pCDH-CMV/ pCDH-sh-MAT2A-l、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-2、pCDH-MATlA/pCDH-U6、pCDH-MATIA/ pCDH-sh-MAT2A-l、pCDH-MATlA/pCDH-sh-MAT2A-2 的 SMMC-7721 细胞稳定株。
[0023] 图5是稳定株中MAT1A与MAT2A蛋白含量Western blot检测图。以GAPDH为 内参，Control、pCDH+sh-MAT2A-l、pCDH+sh-MAT2A-2、MATlA+pCDH、MATlA+sh-MAT2A-l、 MAT lA+sh-MAT2A-2分别代表转染的质粒载体类型为pCDH-CMV/pCDH-U6、pCDH-CMV/ pCDH-sh-MAT2A-l、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-2、pCDH-MATlA/pCDH-U6、pCDH-MATIA/ pCDH-sh-MAT2A-l、pCDH-MATlA/pCDH-sh-MAT2A-2 的 SMMC-7721 细胞稳定株。
[0024] 图6是稳定株诱导HUVECs (脐静脉内皮细胞）管生成结果图。SFM、TCM、MAT1A、 sh-MAT2A-2、MATlA+sh-MAT2A-2分别代表无血清培养基、未转染细胞、转染pCDH-MATIA细 胞、转染 pCDH-sh-MAT2A-2 细胞、转染 pCDH-MATlA/pCDH-sh-MAT2A-2 的 SMMC-7721 细胞上 清液。
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