具有抑制hiv-1的卷曲螺旋结构蛋白8及其应用

文档序号:9320572阅读:732来源:国知局
具有抑制hiv-1的卷曲螺旋结构蛋白8及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域,涉及一种新的具有抑制HIV-1的蛋白,具体来说,可以 通过诱导HIV-1 Gag的多泛素化和降解达到抗HIV-1的作用。
【背景技术】
[0002] 由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV-1)或称艾滋病病毒 引起的艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)在全球已经流行了 30多 年。艾滋病属于烈性传染病,病毒直接攻击人体免疫系统,导致人体免疫机能缺陷,易于发 生机会性感染和肿瘤,多数死亡。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)报 道,截止2013年底,全世界约有3500万HIV-1存活感染者,另有大约3000万人已经死亡, 总计大约6500万人。2013年新发HIV-1感染者约为210万,当年死于艾滋病的病人约为 150万(http://www.who. int)。迄今为止,依然没有有效的抗艾滋病疫苗。虽然抗逆转录 病毒药物以及抗病毒疗法(antiretroviral therapy,ART)已经取得很大的进展,能够有效 控制病毒的复制,但依然不能彻底清除病毒,不能治愈艾滋病。艾滋病在全世界已经造成重 大的经济损失。
[0003] 我国也同样经历了艾滋病的打击。据中国卫生部和联合国艾滋病规划署报道, 截至2011年底,估计中国存活HIV-1感染者和艾滋病病人78万人(62~94万人),女性 占28. 6 % ;艾滋病(AIDS)病人15. 4万人(14. 6~16. 2万人);全人群感染率为0. 058% (0. 046%~0. 070% )。估计2011年当年新发HIV-1感染者4. 8万人(4. 1~5. 4万人), 2011年艾滋病相关死亡2. 8万人(2. 5~3. 1万人)。同样,中国的艾滋病流行情况也不容 乐观。
[0004] HIV-1属于逆转录病毒科慢病毒属的病毒。HIV-1的基因组大约9. 8kb (图1. HIV-1 HXB2基因组结构图)。两端带有长末端重复序列LTR(Long Terminal R印eat)区,HIV-1 主要结构蛋白包括衣壳Gag、酶Pol和膜蛋白Env。Gag蛋白全长55KD,包括基质蛋白区 pl7(Matrix,MA)、衣壳蛋白 p24(Capsid,CA)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid,NC)和 p6。Pol 负责编码病毒蛋白酶、整合酶和逆转录酶。Env负责编码膜蛋白Gpl20和Gp41。HIV-1还编 码一些调节蛋白,如Vif、Vpu、Vpr、Tat、Rev和Nef。Vif蛋白诘抗人体产生的抗病毒蛋白 胞嘧啶脱氨酶(AP0BEC3G)的抗病毒作用。Vpu拮抗另一个人体产生的抗病毒蛋白粘附素 Tetherin的粘附作用。Vpr诱导感染细胞周期的G2/M期停滞,促进感染细胞凋亡。Tat通 过和HIV-1 LTR区的Tar结构结合,反式激活HIV-1的转录。Rev负责和HIV-1 Rev反应原 件RRE (Rev Respond Element)结合,把HIV-1的基因组从细胞核转运到细胞浆,进行蛋白 翻译和病毒的包装。Nef蛋白可以下调CD4,增强病毒的复制和感染性。
[0005] 目前,已经有的抗HIV-1药物包括抗逆转录酶抑制剂、蛋白酶、整合酶和病毒进入 细胞抑制剂。抗逆转录酶药物是最早开发的药物,如叠氮胸苷(AZT);蛋白酶抑制剂,如赛 科纳瓦(Saquinavir);整合酶抑制剂,如雷特格韦(Raltegravir);病毒进入抑制剂,如马 拉维诺(Maraviroc)等。这些药物单一使用易诱发耐药,经常多个药物联合使用。即使联 合使用,依然会引发耐药性。而且药物本身的毒性会引起病人强烈的副作用,副作用会使病 人不愿意继续服药,导致依从性不好。
[0006] 泛素(Ubiquitin,Ub)是含有76个氨基酸的小蛋白,在真核细胞中高度保守。泛 素在泛素活化酶E1,泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的作用下,将泛素连接在目的蛋白上, 称为泛素化。单一泛素化蛋白仅仅是一种蛋白的修饰方式,而多泛素化蛋白(超过5个以 上)就会导致目的蛋白进入降解系统。泛素-蛋白降解系统也是研究最深入的蛋白降解机 制。

【发明内容】

[0007] 本发明目的是解决现有药物治疗艾滋病引起的毒副作用、耐药性问题、依从性问 题,以及不能彻底治愈艾滋病的问题,提供一种具有强烈抑制HIV-1的人体细胞编码的蛋 白卷曲螺旋结构蛋白8及其应用。
[0008] 本发明首先提供了一种具有强烈抑制HIV-1的人体细胞编码的蛋白卷曲螺旋结 构蛋白 8(Coiled_coil domain containing protein 8,CCDC8),基因序列和蛋白序列见 SEQ ID No. 1 (CCDC8 被克隆在载体 pTT5-SH5 里)和 SEQ ID No. 2。
[0009] 本发明同时提供了一种具有抗HIV-1活性的卷曲螺旋结构蛋白8截短体的N末端 蛋白,基因序列和蛋白序列见SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4。
[0010] 所述的卷曲螺旋结构蛋白8或卷曲螺旋结构蛋白8截短体的N末端蛋白可应用于 治疗HIV-1药物的制备中。
[0011] 同时,所述的卷曲螺旋结构蛋白8和0BSLUE3泛素连接酶Cul7在引起HIV-1 Gag 泛素化降解的新通路在抗HIV-1方面的应用。所述的应用包括抗体、小分子化合物和多肽 药物的研发与构建。
[0012] HIV-1可以形成全病毒颗粒。但是HIV-1单独的Gag蛋白(vGag-RRE)或GagPol 蛋白(vGag/GagPol-RRE)可以形成病毒样颗粒(Virus like particles,VLP),即不含有 病毒全基因组,仅仅为病毒衣壳蛋白,没有感染性。为检测病毒里含有哪些人体细胞产生 的蛋白,我们把病毒样颗粒进行了蛋白考马斯亮蓝染色(图2),把每一条带切下来,进行 了蛋白测序、质谱分析,发现了很多功能未知的蛋白序列。随机选择了几十个基因,通过 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),将基因克隆入pTT5-SH5 (带有组氨酸His标签)载体里。 在人HEK293T细胞中表达,发现有一个蛋白,即卷曲螺旋结构蛋白8 (Coiled-coil domain containing protein 8, CCDC8)可以强烈抑制 HIV-1。
[0013] 在体外细胞水平上,外源表达(XDC8具有极强的抗HIV-1活性。如图3A所示,在 人HEK293T细胞中,共同表达质粒pTT5-SH5-CCDC8和HIV-1 BH10 (为HIV-1的感染性克 隆,可以产生具有感染性的HIV-1),48小时后收获细胞和病毒进行蛋白检测。随着CCDC8 表达量的增加,HIV-1的产量显著降低,但并不影响HIV-1 Gag p55在细胞中的表达。(XDC8 的抗病毒活性与它的表达量成正相关,可以导致HIV-1 Gag达到10-30倍的降低。而同样 表达的PTT5-SH5-EGFP (绿色荧光蛋白)却没有抗病毒活性。图3B把3A的结果用曲线图 的形式表现出来,我们可以看到细胞外的病毒P24,在表达CCDC8时显著降低。由于p24是 Gag p55经病毒蛋白酶剪切后的产物,细胞内p55在有CCDC8时表达不低(图3A),但是细 胞内P24却显著降低,提示CCDC8可能会抑制病毒蛋白酶的活性。为测试这一结果,我们使 用了病毒蛋白酶阴性的HIV-1 (HIV-1 BH10 P-),即病毒蛋白酶第25位的天冬氨酸被突变 成甘氨酸(D25G),病毒蛋白酶活性丧失。我们发现,CCDC8依然可以抑制病毒蛋白酶阴性的 HIV-1 (HIV-1 P-)的产量(图3C),这一结果表明(XDC8抑制HIV-1的产量,并不是通过抑制 病毒蛋白酶的作用。另外,CCDC8不但可以抑制HIV-1全病毒的产量,还可以抑制病毒样颗 粒 Gag(vGag-RRE)或 GagPol 蛋白(vGag/GagPol-RRE)的产量(图 3D)。CCDC8 对于 HIV-1 的抑制是特异的,并不抑制另外一种无关的蛋白赖氨酸合成酶(LysRS)的表达(图3E)。 而且,在表达(XDC8的细胞中,产生的HIV-1的病毒感染性也降低了大约6-7倍,这一结果 通过将相等体积的HIV-1病毒(图3F)或相同p24的病毒感染带有HIV-1 LTR启动子的荧 光素酶(luciferase)基因细胞系(Hela-TZMbl)而得到(图3G)。
[0014] 本发明的优点和有益效果:
[0015] 本发明提供的人体细胞产生的蛋白卷曲螺旋结构蛋白8(Coiled_coil domain containing protein 8,CO)C8)具有极强的抗HIV-1的作用,可以通过和HIV-1 Gag的基 质蛋白区结合,阻止Gag蛋白在细胞膜上的组装。卷曲螺旋结构蛋白8和0BSL1、E3泛素连 接酶Cul7 -起引起HIV-1 Gag的内化、多泛素化和降解。本发明基于卷曲螺旋结构蛋白8 构建了一个新的质粒即表达卷曲螺旋结构蛋白8截短体的N末端蛋白,该蛋白包含274个 氨基酸,可以降解HIV-1。
【附图说明】
[0016] 图1是HIV-1的标准株HXB2的基因组结构图(从www. hiv. lanl. gov下载)。
[0017] 图2是(XDC8在HIV-1中的发现,HIV-1病毒样颗粒Gag和病毒蛋白酶阴性GagPol 经过考马斯亮蓝染色图。
[0018] 图3是(XDC8具有极强的抗HIV-1活性蛋白印迹检测图,其中,A是将HIV-1 BH10(2y g)和 pTT5-SH5-CCDC8(0、l、2、4y g)共转染 HEK293T 细胞,48 小时后,收获细胞 (Cell)和上清(Virus),进行蛋白印迹检测后得到的结果。抗体使用抗Gag,抗Actin和 抗His标签。B是将A的结果做相对定量分析后做成的图。C是将HIV-1 BH10换成HIV-1 BH10 P-(蛋白酶阴性)重复A实验的结果。D是将HIV-1 vGag/GagPol-RRE加Rev,或者 vGag-RRE 加 Rev 分别与 Vector 或 pTT5-SH5-CCDC8(C8)共转染 HEK293T 细胞,48 小时后 进行蛋白印迹检测的结果。E是将带有V5标签的赖氨酸合成酶LysRS单独(None)或与 PTT5-SH5-CCDC8 (C8)、p!T5-SH5 空载体(Vector)、p!T5-SH5-EGFP 转染,48 小时后使用蛋白 印迹实验检测V5。F是将共转染HIV-1 BH10和pTT5-SH5-EGFP
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