利用RNAi沉默翻译起始因子基因培育抗花叶病甘蔗的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种培育甘蔗抗病品种的方法，具体涉及一种利用RNAi沉默翻译起 始因子基因培育抗甘蔗花叶病品种的方法，即利用RNAi技术干扰甘蔗中真核翻译起始因 子基因SceIF4El和SceIF4E2培育抗甘蔗花叶病转基因甘蔗的方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 甘鹿（Saccharum sp. hybrid)是我国乃至全世界最重要的糖料作物和能源作物， 甘蔗糖占我国食糖总量的92%，占世界食糖总量的74%，甘蔗乙醇占世界生物质燃料乙醇 的60%。甘蔗花叶病是严重危害甘蔗生产的病毒性病害之一，在我国广西、云南、广东、海南 等地蔗区普遍发生（李文凤等，2007 ;许东林等，2008)。甘蔗感染花叶病后，叶片出现黄绿 相间、大小不一的条纹，种苗萌芽率下降，分蘖减少，植株矮小，生长缓慢，品质变劣，蔗糖结 晶率下降（Joyce et al.，1998 ;Wu et al.，2012 ;Li et al.，2013)。甘鹿花叶病的病原主 要有3种，即甘蔗条纹花叶病毒SCSMV，甘蔗花叶病毒（Sugarcane Mosaic Virus, SCMV)和 高梁花叶病毒（Sorghum mosaic virus, SrMV)，均属于马铃墓Y病毒科（Potyviridae)(李 文凤等，2007 ;许东林等，2008 ;Xu et al.，2008 ;熊果如等，2011)。SCMV和SrMV属于马 铃薯Y病毒属（Potyvirus)。SCSMV于1978年在美国首次发现并报道，1998年确定其属于 Potyviridae，2012 年国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)将其立为该科新属，即禾病毒属（Poacevirus) (http://www. ictvonline. org)。SCSMV主要分布在中国、孟加拉、印度、日本、印度尼西亚、巴基斯坦等地，在中国甘蔗 主产区广西、云南呈现爆发式流行，在广东、浙江和福建等地普遍发生并广泛传播（Li et &1.，2011)，田间发病率达到50%时，产量损失高达20%(?11廿3 6七&1.，2013)。
[0003] SCMV，SrMV和SCSMV均为单链正义RNA病毒，基因组结构简单，长度约为10Kb， 编码一个大的多聚蛋白（ployprotein)，经酶解后形成10个成熟蛋白，从N端到C端依次 为：第一蛋白（P1)、辅助成分-蛋白酶（helper component proteinase，HC-Pro)、第三蛋 白（P3)、第一个 6K 蛋白（6K1)、柱状内含体蛋白（cylindrical inclusion protein, CI)、 第二个6K蛋白（6K2)、病毒的末端结合蛋白（Viral Protein Genome-linked，VPg)、核内含 体 a 蛋白（Nuclear Inclusion a protein, NIa)、核内含体 b 蛋白（Nuclear Inclusion b protein, Nib)和外壳蛋白（Coat Protein, CP) (Riechmann et al. , 1992 ；Urcuqui-Inchima et al.，2001)。另外，在P3基因内部，在G2A7保守结构域发生移码，编码一个新的蛋白，为 P3NPIP0(Chung et al. , 2008 ；ffei et al. , 2010 ；Vijayapalani et al. , 2012)〇
[0004] 植物病毒作为一种细胞内专性寄生物，必须借助寄主的某些特异因子，才能在寄 主体内建立侵染，完成翻译、复制、运动等基本生命活动（Charron et al.，2008)。植物病毒 在寄主体内的翻译是病毒完成系统性侵染的关键环节。研究发现，在马铃薯Y病毒科病毒 翻译的过程中，VPg起到关键作用。由于该类病毒基因组的端没有帽子结构m7GpppN(N 为任意核酸），病毒要完成翻译，必须通过其编码的VPg充当帽子结构与真核翻译起始因子 (Eukaryotic translation initiation factor, elF)互作，形成四聚体并招募其他因子， 才能启动病毒 RNA 翻译（Murphy et al.，1991，1996)。
[0005] 翻译起始因子eIF4E是马铃薯Y病毒科病毒在寄主体内启动翻译的必须寄主因 子，长期被病毒选择利用，在病毒生命活动中的功能具有相对的保守性和稳定性，是病毒与 植物协同进化的产物（Charron et al.，2008)，这类寄主因子基因突变产生的隐性抗病基 因具有广谱性和持久性（Pavan et al.，2010)。隐性抗病基因在抗病毒植物中普遍存在， 因其对病毒的广谱抗性，被广泛应用于作物抗病育种。最近10年，随着病毒与寄主的互作 研究的深入，发现这些隐性抗病基因在生物学本质上都是与病毒互作的寄主因子基因的突 变体，如辣椒中抗马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY)和烟草蚀刻病毒（Tobacco etch virus, TEV)的 pvr2、抗辣椒叶脉斑驳病毒（Pepper vein mottle virus, PVMY)的 pvr6,碗 豆中抗豌豆种传花叶病毒（Pea seed-born mosaic virus, PSbMV)的sbml等，都是与病毒 互作的寄主翻译起始因子基因eIF4El或eIF4E2的突变体。这种抗性非常持久，辣椒的抗 PVMY的pvr6使用了 50多年，依然有效。已经报道的12个的对马铃薯Y病毒具有抗性的 隐性抗病基因，其中7个自然突变产生的，5个是通过T-DNA基因敲除等方法产生的，都是 翻译起始因子基因的突变体（Robaglia&Caranta, 2006 ;Maule et al.，2007 ;Truniger et al. , 2009) 〇
[0006] 寄主隐性抗病基因的这种因失去与病毒互作能力而产生对病毒广谱抗性的功能， 为利用RNAi技术开展广谱抗病转基因研究奠定了生物学基础。利用RNAi技术，已经成功 的沉默了拟南芥、西红柿等植物的翻译起始因子基因，获得了具有广谱抗性的突变体。拟南 芥AteIF4El基因突变时，产生了对苜蓿黄脉病毒（Clover yellow vein virus, C1YVV)的 抗性；AteIF4E2基因突变时，突变株产生了对芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus, TuMV)、 萬苣花叶病毒（Lettuce mosaic virus, LMV)和李痕病毒（Plum pox virus, PPV)的抗性 (Duprat et al.，2002 ;Sato, 2005 ;Decroocq et al.，2006)。在西红柿中，沉默SleIF4El基 因，突变株同时免疫马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY)和辣椒斑驳病毒（P印per mottle virus，P印MoV)两种病毒（Piron et al.，2010)，同时沉默番茄的 SleIF4El 和 SleIF4E2 基因，突变株产生的对PVY、TEV、辣椒斑驳病毒（P印per mottle virus，P印MoV)、彩叶 椒病毒（Ecuadorian rocotto virus, ERV)、辣椒重型花叶病毒（Pepper severe mosaic virus, PepSMV)、辣椒黄花叶病毒（Pepper yellow mosaic virus, PepYMV)及马铃薯 V 病毒 (Potato virus V，PVV)共7种病毒的抗性（Mazier et al.，2011)。特别值得注意的是，在 这些具有广谱抗性的突变体中，都出现了表型没有或基本没有发生变化，能够正常生长发 育、完成生命周期的株系（Duprat et al.，2002 ;Sato, 2005 ;Decroocq et al.，2006 ;Piron et al. , 2010 ；Mazier et al.,2011)〇
[0007] 甘蔗花叶病病原主要由蚜虫以非持续性方式传播，通过常规手段难以防止。抗花 叶病一直是甘蔗育种目标之一，通过传统的杂交方式，可以选育出抗花叶病的甘蔗品种。但 是，因为花期不遇、优良基因型难以聚合、周期长等原因，很难获得高产高糖等农艺性状与 抗花叶病聚合的基因型。由病毒自身基因介导的转基因植株抗病性（pathogen-derived resistance，PDR) (Abel et al.，1986)的发现和转基因技术的发展，使利用生物工程手 段培育抗花叶病转基因甘蔗成为可能。PDR的原理是RNAi，RNAi技术是在真核生物体内 发生的、基于核酸序列同源性的一种基因表达调控机制。即双链RNA (double-stranded RNA，dsRNA)被Dicer降解为21-26nt的小干扰RNA，而后者指导同源RNA进行识别和切 害J，导致靶标mRNA的降解，从而造成基因沉默。RNAi技术已经应用与抗花叶病转基因甘 蔗材料的培育，但是其干扰对象主要是病毒的CP基因，由于CP基因多态性非常高，获得 的转基因材料仅对CP基因来源病毒株系免疫，对同一病毒的其他株系抗性不足或失去抗 性。J 〇yce(1998)将SCMV-E的外壳蛋白基因（CP)转入甘蔗，随机取田间发病甘蔗叶片 汁液（未明确病毒种类和株系）对突变体摩擦接种，突变体产生由抗到感一系列类型。 Ingelbrecht(1999)将 SrMV-H 株系的 CP 基因导入甘蔗，以 SrMV-H、SrMV-I、SrMV-M 和 SCMV-D对