海藻糖合成酶-海藻糖水解酶融合酶及其表达基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及海藻糖合成酶-海藻糖水解酶融合酶及其表达基因与应用，特别涉及 麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶及其表达基因与应用，属于基 因工程和酶工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 海藻糖是一种普遍存在的非还原性双糖，由葡萄糖通过a -1，1糖苷键连接，其中 a，a -1，1-海藻糖目前已被分离，并被发现广泛存在于植物、动物及微生物中。天然的海藻 糖对生物体或生物大分子具有较好的且非特异性的保护作用，可以使得具备海藻糖的生物 体能够度过饥饿、干燥、低温、高温、辐射等恶劣环境。随着对海藻糖认知程度的增加，海藻 糖在各方面的应用不断得到拓展，在医药、食品、农业等领域得到广泛推广。
[0003] 目前海藻糖的生产工艺主要有三种：
[0004] (1)提取法
[0005] 提取法主要通过培养海藻糖含量较高天然生物来获取，目前主要的提取对象为酵 母（海藻糖含量约占酵母干重的15% )，但由于海藻糖属于酵母内容物，提取时需要进行复 制的破壁及分离提取工艺，因此目前逐渐被酶法制备海藻糖法取代。
[0006] (2)单酶法
[0007] 单酶法在1995年由日本Nishimoto等人首次提出，即采用海藻糖合酶转化麦芽 糖生产海藻糖的工艺。海藻糖合酶能够将a，a-1，4-糖苷键连接的麦芽糖直接转化为 a，a -1，1-糖苷键连接的海藻糖，该转化反应不需要磷酸盐的存在，不需要消耗高能物质， 但该方法所采用的酶热稳定性一般较低，且转化率多为60%左右，另外由于该酶同时具有 轻微的水解活性，因此单酶法转化过程中还会产生少量副产物的葡萄糖。
[0008] (3)双酶法
[0009] 双酶法在1991年由Lama等人首次报道，即采用麦芽寡糖基海藻糖合成酶 (MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase)两种酶利用淀粉为底物生产海藻糖的方 法。该方法中第一种酶用来催化聚合度（DP)大于3的麦芽糊精，转化其还原端的a-1，4 连接键生成a-1，1连接键。第二种酶专一性催化水解a-1，4键生成的a-1，1键海藻糖 和低分子量的麦芽低聚糖。目前双酶法多数以还原性淀粉为原料，转化率多为70-80%左 右，因此较单酶法相比更为经济，除能够生产海藻糖之外，还可以同时产生具有较高附加值 的麦芽三糖，因此该工艺路线已被用于工业化生产。
[0010] 虽然双酶法具有以上诸多优点，但依然存在不足之处：双酶法转化所用两种酶需 要分别进行发酵及纯化才能获取，因此酶的生产成本明显高于单酶法。
【发明内容】
[0011] 本发明针对现有技术的不足，提供麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖 水解酶融合酶及其表达基因与应用。
[0012] 本发明技术方案如下：
[0013] 麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的表达基因，核苷酸 序列如SEQ ID N0:1所示。
[0014] 麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0015] -种重组载体，在质粒中插入上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列。
[0016] 根据本发明优选的，所述质粒为pPIC3. 5K载体质粒或pPIC9K载体质粒。
[0017] -种转基因细胞系，宿主细胞内转化有上述重组载体。
[0018] 根据本发明优选的，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115。
[0019] 上述麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的表达基因、重 组载体或转基因细胞系在制备麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合 酶中的应用。
[0020] 上述麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的表达基因在 制备海藻糖与麦芽三糖中的应用。
[0021] 有益效果
[0022] 本发明的技术方案与现有技术相比具有以下优点：
[0023] 1、本发明采用基因工程技术构建了一种新颖的麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽 寡糖基海藻糖水解酶融合酶，所述融合酶同时具有麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基 海藻糖水解酶两种酶的活性，与传统双酶法相比有效的简化了生产工艺。
[0024] 2、本发明所获得的融合酶融合后的比酶活分别为147. 4U/mg和160. lU/mg，活性 配比合理，与传统双酶法相比无需再考虑两种酶的配比即可实现高效转化，因此本发明所 生产的融合酶在使用时更为简便。
[0025] 3、由于麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的作用底物为麦芽寡糖基海藻糖合成酶 的产物，因此两种酶的融合使得麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶接触底物发挥作用的时间 大大缩短，在相同条件下使用融合酶反应仅20小时海藻糖转化率即可达到85. 3%，较传统 双酶法相比节约了近4小时，能够有效节约生产时间，降低成本，减少染菌概率，因此更适 合工业化生产和应用。
[0026] 4、本发明采用毕赤酵母作为融合酶的生产菌株，与大肠杆菌表达系统相比能够有 效避免内毒素的污染，具有更高的安全性，因此本发明所生产的海藻糖更适合应用于食品 行业。
【附图说明】
[0027] 图1麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶基因PCR构建结 果；
[0028]图中：M、marker，1 和 2、PCR 产物。
【具体实施方式】
[0029] 下面的实施例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
[0030] 实施例1 :Arthrobacter sp?基因组总DNA的提取。
[0031 ] 发明人经过大量筛选，在山东济南市郊区一被污染的农田土壤中发现一株氧化节 杆菌（Arthrobacter sp. )QYW623,其发酵液同时具有较高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦 芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶活性，并且纯化后两种酶的比酶活性比较接近，最适温度均 在55°C左右，在5. 0-5. 8之间均具有较高的催化活性（残余酶活> 85% )，经对该菌中存在 的麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因序列进行克隆，发现两种酶的 基因序列与Arthrobacter sp.L77基因组（NZ_JWSU00000000. 1)中相应酶的基因序列较为 接近，序列一致性均大于99%，但尚未有人对其酶学性质进行研究。
[0032] 将_80°C下保存的氧化节杆菌（Arthrobacter sp.) QYW623菌株接种至LB液体培 养基（蛋白胨l〇g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)中活化培养48小时，其后按