一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌及其制备方法与应用，特别涉及一 种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解 酶融合酶及制造海藻糖的方法，属于基因工程和酶工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 海藻糖是一种普遍存在的非还原性双糖，由葡萄糖通过a -1，1糖苷键连接，其中 a，a -1，1-海藻糖目前已被分离，并被发现广泛存在于植物、动物及微生物中。天然的海藻 糖对生物体或生物大分子具有较好的且非特异性的保护作用，可以使得具备海藻糖的生物 体能够度过饥饿、干燥、低温、高温、辐射等恶劣环境。随着对海藻糖认知程度的增加，海藻 糖在各方面的应用不断得到拓展，在医药、食品、农业等领域得到广泛推广。
[0003] 目前海藻糖的生产工艺主要有三种：
[0004] (1)提取法
[0005] 提取法主要通过培养海藻糖含量较高天然生物来获取，目前主要的提取对象为酵 母（海藻糖含量约占酵母干重的15% )，但由于海藻糖属于酵母内容物，提取时需要进行复 制的破壁及分离提取工艺，因此目前逐渐被酶法制备海藻糖法取代。
[0006] (2)单酶法
[0007] 单酶法在1995年由日本Nishimoto等人首次提出，即采用海藻糖合酶转化麦芽 糖生产海藻糖的工艺。海藻糖合酶能够将a，a-1，4-糖苷键连接的麦芽糖直接转化为 a，a -1，1-糖苷键连接的海藻糖，该转化反应不需要磷酸盐的存在，不需要消耗高能物质， 但该方法所采用的酶热稳定性一般较低，且转化率多为60%左右，另外由于该酶同时具有 轻微的水解活性，因此单酶法转化过程中还会产生少量副产物的葡萄糖。
[0008] (3)双酶法
[0009] 双酶法在1991年由Lama等人首次报道，即采用麦芽寡糖基海藻糖合成酶 (MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase)两种酶利用淀粉为底物生产海藻糖的方 法。该方法中第一种酶用来催化聚合度（DP)大于3的麦芽糊精，转化其还原端的a-1，4 连接键生成a-1，1连接键。第二种酶专一性催化水解a-1，4键生成的a-1，1键海藻糖 和低分子量的麦芽低聚糖。目前双酶法多数以还原性淀粉为原料，转化率多为70-80%左 右，因此较单酶法相比更为经济，除能够生产海藻糖之外，还可以同时产生具有较高附加值 的麦芽三糖，因此该工艺路线已被用于工业化生产。
[0010] 虽然双酶法具有以上诸多优点，但依然存在不足之处：双酶法转化所用两种酶需 要分别进行发酵及纯化才能获取，因此酶的生产成本明显高于单酶法。
[0011] 枯草芽孢杆菌启动子是实现基因高效表达的关键元件之一。近年来，在启动子的 研究方面开展了大量的工作并取得了长足的进展，克隆获得了一批可以应用于枯草芽孢杆 菌的启动子。但是，枯草芽孢杆菌的现有启动子在数量、表达量和调控方式等方面存在着诸 多问题。需要进一步研究和完善，获得更多表达强度高，诱导调控方便的启动子元件。
[0012] 对于来自于解淀粉芽孢杆菌的PamyQ启动子来说，用淀粉诱导目的蛋白产生，该 淀粉诱导物即能够诱导目的蛋白产生，反过来得到的目的蛋白酶以淀粉为底物直接转化为 海藻糖，增加了海藻糖合成的转化率，对于制造海藻糖来说具有重要意义。同时PamyQ系统 的诱导物淀粉相对于IPTG和木糖来说，价格便宜，成本低，且对细菌本身无毒性，因此在工 业上很有实用价值。
【发明内容】
[0013] 本发明主要针对现有技术的不足，提供一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌及其制 备方法与应用。
[0014] 本发明技术方案如下：
[0015] -种重组载体，其特征在于，在PHT43质粒的BamHI酶切位点前通过连续三次重叠 PCR方式将Pgrac启动子替换成a -淀粉酶启动子PamyQ，然后在BamHI酶切位点后插入麦 芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶基因；
[0016] 所述的a -淀粉酶启动子PamyQ核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，麦芽寡糖基海 藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示；麦芽寡糖 基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶氨基酸序列如SEQ ID N0. 3所示。
[0017] 上述重组质粒载体的制备方法，步骤如下：
[0018] (i)以穿梭质粒PHT43为模板，进行PCR扩增，得到PHT片段；
[0019] 所述的PCR引物序列如下：
[0020] PHT-up: 5，-ACTCAAACATCAAATCTTACAAA-3 '
[0021] PHT-down: 5 ' -CTTTTCGTATGTGCGGGGCGTGATAAGATAAAAAATTTTTCACGCTTACATCAT-3 '
[0022] 所述的PCR扩增体系为50 y 1 :
[0023] 2XTaq PCR MasterMix 25 yl,弓丨物 PHT-up (10 y mol/L) 2. 5 y 1，弓丨物 PHT-down (10 y mol/L) 2. 5 y 1，模板 2. 5 y 1，用 ddH20 补足 50 y 1 ;
[0024] 所述的PCR扩增程序如下：
[0025] 95°C预变性 5min ;95°C变性 30sec，51°C退火 30sec，72°C延伸 40sec，30 个循环； 72°C延伸 10min，-20°C保存；
[0026] (ii)提取B. amyloliquefaciens菌体的DNA，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到 PamyQ片段；
[0027] 所述的PCR引物序列如下：
[0028] PamyQ-up: 5 ' -TTTTATCTTATCACGCCCCGCACATACGAA-3 '
[0029] PamyQ-down: 5 ' -TTCCTCCTTTAATTGGGAAGCACAAGTCTGAACGAAA-3 '
[0030] 所述的PCR扩增体系为50 y 1 :
[0031] 2XTaq PCR MasterMix 25u1，引物 PamyQ-up(10umol/L)2. 5u1，引物 PamyQ-down (10 y mol/L) 2. 5 y 1，模板 2. 5 y 1，用 ddH20 补足 50 y 1 ;
[0032] 所述的PCR扩增程序如下：
[0033] 95°C预变性 5min ;95°C变性 30sec，63°C退火 30sec，72°C延伸 40sec，30 个循环； 72°C延伸 10min，-20°C保存；
[0034] (iii)以穿梭质粒PHT43为模板，进行PCR扩增，得到SamyQ片段；
[0035] 所述的PCR引物序列如下：
[0036] SamyQ-up: 5，-GTGAGCGGATAACAATTCCCAATTAAAGGAGGAAGG-3，
[0037] SamyQ-down: 5 ' -GGATCCTACGGCTGATGTTTTTGT-3 '
[0038] 所述的PCR扩增体系为50 y 1 :
[0039] 2XTaq PCR MasterMix 25u1，引物 SamyQ-up(10umol/L)2. 5u1，引物 SamyQ-down (10 y mol/L) 2. 5 y 1，模板 2. 5 y 1，用 ddH20 补足 50 y 1 ;
[0040] 所述的PCR扩增程序如下：
[0041] 95°C预变性 5min ;95°C变性 30sec，51°C退火 30sec，72°C延伸 40sec，30 个循环； 72°C延伸 lOmin，-20°C保存；
[0042] (iv)将步骤⑴制得的PHT片段与步骤（ii)制得的PamyQ片段进行重叠PCR，制 得 PHT-PamyQ 片段；
[0043] 所述的重叠PCR的初次扩增体系为25 y 1 :
[0044] PHT片段4yl ;PamyQ片段4yl ;2XTaq PCR MasterMix 12.5yl ;ddH20 4.5 yl ;
[0045] 所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
[0046] 95°C预变性 5min ;94°C变性 30sec，63°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，5 个循环； 72°C 延伸 2min ;
[0047] 所述的重叠PCR的补充扩增体系为25 y 1 :
[0048] 上游引物 PHT-up 2 u 1 ;下游引物 PamyQ-down 2 u 1 ;2 X Taq PCR MasterMix 12. 5 y 1 ；ddH20 8. 5 y 1 ；
[0049] 所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
[0050] 95°C预变性 5min ;94°C变性 30sec，63°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，30 个循环； 72°C延伸 10min，-20°C保存；
[0051] (v)将步骤（ii)制得的PamyQ片段与步骤（iii)制得的SamyQ片段进行重叠PCR， 制得PamyQ-SamyQ片段；
[0052] 所述的重叠PCR的初次扩增体系为25 y 1 :
[0053] PamyQ 片段 4 y 1 ;SamyQ 片段 4 y 1 ;2XTaq PCR MasterMix 12. 5 y 1 ;ddH20 4. 5 y 1 ；
[0054] 所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
[0055] 95°C预变性 5min ;94°C变性 30sec，51 °C退火 30sec，72°C延伸 40sec，5 个循环； 72°C 延伸 2min ;
[0056] 所述的重叠PCR的补充扩增体系为25 y 1 :
[0057]上游引物 PamyQ-up 2u1 ;下游引物 SamyQ-down 2u1 ;2XTaq PCR MasterMix 12. 5 y 1 ；ddH20 8. 5 y 1 ；
[0058] 所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
[0059] 95°C预变性 5min ;94°C变性 30sec，51°C退火 30sec，72°C延伸 40sec，30 个循环； 72°C延伸 10min，-20°C保存；
[0060] (vi)将步骤（iv)制得的PHT-PamyQ片段与步骤（v)制得的PamyQ-SamyQ片段进 行重叠PCR，制得PHT-PamyQ-SamyQ片段；
[0061 ] 所述的重叠PCR的初次扩增体系为25 y 1 :
[0062] PHT-PamyQ 片段 4 y 1 ;PamyQ-SamyQ 片段 4 y 1 ;2 X Taq PCR MasterMix 12. 5 y 1 ; ddH20 4. 5 y 1 ；
[0063] 所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
[0064] 95°C预变性 5min ;94°C变性 30sec，51°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，5 个循环； 72°C 延伸 2min ;
[0065] 所述的重叠PCR的补充扩增体系为25 y 1 :
[0066] 上游引物 PHT-up 2 u 1 ;下游引物 SamyQ-down 2 u 1 ;2 X Taq PCR MasterMix 12. 5 y 1 ；ddH20 8. 5 y 1 ；
[0067] 所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
[0068] 95°C预变性 5min ;94°C变性 30sec，51°C退火 30sec，72°C延伸 lmin，30 个循环； 72°C延伸 lOmin，-20°C保存；
[0069] (vii)将步骤（vi)制得的 PHT-PamyQ-SamyQ 片段连接到 pTO