一种pKD46-arr-3质粒及其制备方法

文档序号:9320600阅读:1865来源:国知局
一种pKD46-arr-3质粒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域,具体涉及分子生物学和基因工程。
【背景技术】
[0002] 质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位,广泛存在于许多生物中,习惯上 用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子,也是分子生物学技术中 常用到的一种工具分子。
[0003]pKD系列载体主要有pKD3、pkD4、pKD 13、pKD32和pKD46等,是通过同源重组方法用 来制备细菌基因缺陷株的工具质粒,其中PKD46主要用于革兰阴性杆菌的基因敲除。pKD46 的筛选标签是氨苄抗性基因,但是临床菌株的氨苄天然耐药现象很普遍,特别是一些革兰 阴性肠杆菌科细菌的氨苄天然耐药尤为普遍,这就限制了 PKD46质粒在这些具有氨苄耐药 性的菌株中的应用。未解决上述技术问题,本发明由此而来。

【发明内容】

[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种为临床耐氨苄菌株的相关研究提供基因敲 除所需的工具质粒。
[0005] 为了解决上述的技术问题,本发明提供了一种pKD46-arr-3质粒,所述质粒包括 PKD46载体基因片段和利福平抗性基因arr-3。
[0006] 所述的利福平抗性基因arr-3连接有自身天然启动子,所述启动子序列如Seq No. 6所示。
[0007] 连接有启动子的利福平抗性基因arr-3全序列如Seq No. 1所示。
[0008] 所述pKD46载体基因片段为切除了氨苄抗性基因的pKD46载体基因片段,且在原 氨苄抗性基因相同的位点连接有自身天然启动子的利福平抗性基因arr-3。本发明通过 PKD46载体中的两个PvuI和BssS I酶切位点切除氨苄抗性基因,并在此连接有自身天然 启动子的利福平抗性基因arr-3,其序列如Seq No. 1所示。
[0009] 本发明的第二方面提供了一种具有利福平抗性基因的pKD46-arr-3质粒的构建 方法,其特征在于,包括如下步骤:
[0010] (l)PCR扩增或者合成得到含有Pvu I和BssS I酶切位点的带自身自动子的利福 平抗性基因arr-3,所述基因片段序列如Seq No. 1所示;
[0011] (2)将pKD46质粒和步骤⑴获得的利福平抗性基因arr-3都用Pvu I和BssS I 酶切后连接;
[0012] (3)将步骤⑵获得的连接产物转化受体菌;
[0013] (4)鉴定阳性克隆,获得重组质粒pKD46-arr-3。
[0014] 根据本发明的优选技术方案,利福平抗性基因arr-3还连接有自身天然启动子序 列,启动子序列如Seq No. 6所示。
[0015] 根据本发明的优选技术方案,上述步骤(1)中PCR扩增利福平抗性arr-3的步骤 包括:
[0016] (A)以经基因组测序验证携带利福平抗性基因arr-3的肺炎克雷伯菌基因组DNA 为模板,以PlA(Pvu I)/P1B为引物扩增出利福平抗性基因启动子序列,其中,
[0017] PlA(Pvu I)引物为:GAATCGATCGAACCACTTCATCCGGGGTCA,如 Seq No. 2 所示;
[0018] P1B 引物为:GAITTGGCTGCATAACTITGTITTAGGGCGACTG,如 Seq No. 3 所示;
[0019] (B)以上述耐利福平的肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板,分别以P2A/P2B(BssS I) 为引物扩增出利福平抗性基因arr-3的CDS序列,其中
[0020] P2A 引物为:CAGTCGCCCTAAAACAAAGTTATGCAGCCAAATC,如 Seq No. 4 所示;
[0021] P2B(BssS I)引物为:GCATCTCGTGGCAAAGGACTAGTCTTCAATGACGTG,如 Seq No. 5 所 示;
[0022] (C)将步骤(A)和(B)的PCR产物纯化后混合作为模板,以P1A (Pvu I) /P2B (BssS I)为引物进行第二轮PCR扩增获得携带启动子的利福平抗性基因arr-3全长。
[0023] 本发明的具有利福平抗性基因的pKD46-arr_3质粒,经过转入临床分离的耐氨苄 的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌等菌株用于靶标基因的敲除。
[0024] 本发明用利福平抗性基因取代pKD46质粒原有的氨苄抗性筛选标签,通过改造现 有的PKD46质粒成携带利福平抗性基因的pKD46质粒,并应用此改造质粒用于具有氨苄抗 性菌株的基因敲除。
【附图说明】
[0025] 图1为本发明的pKD46-arr-3质粒的构建路线图。
[0026] 图2为PCR检测利福平抗性基因arr-3电泳图。
【具体实施方式】
[0027] 以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解,这些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体应用要求的条 件做进一步调整,未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
[0028] 材料和仪器
[0029] BssS I和Pvu I内切酶、Taq酶、T4连接酶均购自Takara公司;
[0030] 电泳级琼脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨、琼脂粉等购自生工生物工程(上海)股份 有限公司。
[0031] pKD46质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司。肺炎克雷伯菌购于南京便诊生物科 技有限公司。
[0032] PCR仪-BioRad公司(美国),凝胶成像系统-BioRad公司(美国),DYY-6C型电 泳仪-上海六一仪器厂。
[0033] 具体方法
[0034] 1.根据利福平抗性基因arr-3序列信息,设计两对特异性PCR引物P1A (Pvu I) / P1B和P2A/P2B (BssS I),以分别扩增利福平抗性基因启动子序列和⑶S序列,在P1B、P2A 的5'端共有21个互补配对的碱基用以定向连接利福平抗性基因启动子和CDS片段,在 PlA(Pvu I)、P2B(BssS I)的 5'端分别加 Pvu I 和 BssS I 酶切位点。
[0035] PlA(Pvu I)引物为:GAATCGATCGAACCACTTCATCCGGGGTCA,如 Seq No. 2 所示;
[0036] P1B 引物为:GAITTGGCTGCATAACTITGTITTAGGGCGACTG,如 Seq No. 3 所示;
[0037] P2A 引物为:CAGTCGCCCTAAAACAAAGTTATGCAGCCAAATC,如 Seq No 4 所示;
[0038] P2B(BssS I)引物为:GCATCTCGTGGCAAAGGACTAGTCTTCAATGACGTG,如 Seq No. 5 所 不。
[0039] 2?目的基因的获取
[0040] 第一轮PCR :以经基因组测序验证携带耐利福平抗性基因arr-3的肺炎克雷伯菌 基因组DNA为模板,分别以PlA(Pvu I)/P1B和P2A/P2B(BssS I)为引物扩增出利福平抗性 基因启动子序列和CDS序列,反应体系如下:
[0041 ]
[0042] 55°C退火30s,72°C延伸40s,进行30个循环。反应后的PCR产物,取5yL进行琼 脂糖凝胶电泳,之后EB染色,利用凝胶分析系统成像判定扩增结果。扩增后的产物进行酚 仿抽提纯化备用。
[0043]
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