抑制植物病原真菌的重组利迪链霉菌的构建方法与应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及生物工程领域中抑制植物病原真菌的重组利迪链霉菌的构建方法与 应用。
【背景技术】
[0002] 我国是以种植业为基础的农业大国，许多重大病害，如灰霉病、炭疽病、番茄叶霉 病、西瓜枯萎病、小麦赤霉病等对农业生产造成了严重损失（陈军等，2010)。每年通过使用 农药可减少经济损失达300亿元左右，但是化学防治起主要作用，化学农药施用量占农药 用量的80%以上，造成严重的环境污染、农药残留、抗性增加等，严重威胁着人类的健康和 生态环境。因此，生物防治是农药发展的必然趋势，由于微生物及其代谢产物具有高度专一 性，杀虫效率高，不杀伤天敌，且容易降解，无残留，对人畜无毒，能增强植物的抗病性，刺激 植物生长，同时能够有效缓解化学农药带来的抗药性等（黄定高，2010)。近几年微生物农 药在生产上的推广应用，已经产生了巨大的经济效益、社会效益和生态效益，目前已被很多 国家列入国家重点科研规划。
[0003] 根据用途和防治对象的不同，用于生物防治的微生物种类也很多样，其中链霉菌 由于次生代谢产物丰富而广泛应用于农业生物防治中。但是，作为天然菌株，单一菌株的代 谢产物种类有限，就会出现抑菌机制单一，抑菌能力差，抑菌谱窄等现象。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何提高利迪链霉菌对植物病原真菌的抗菌活性。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了构建重组利迪链霉菌的方法。
[0006] 本发明所提供的构建重组利迪链霉菌的方法，包括将蛋白质的编码基因导入作为 宿主菌的利迪链霉菌中，得到重组利迪链霉菌的步骤；
[0007]将所述蛋白质的命名为RFRP，RFRP是下述的a)或b):
[0008] a)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No. 1的蛋白质；
[0009] b)将序列表中SEQ ID No. 1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
[0010] 为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中SEQ ID No. 1所示的蛋白质的氨基 末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0011] 表1、标签的序列
[0012]
[0013]
[0014] 上述b)中的蛋白质均可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得 到。上述b)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No. 2的第14-1618位核苷酸所示的 DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突 变得到。
[0015] 上述方法中，所述蛋白质的编码基因为如下al)或a2)或a3)或a4)所示的基因：
[0016] al)核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 2的cDNA分子或DNA分子；
[0017] a2)核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 2的第14-1618位的cDNA分子或DNA分 子；
[0018] a3)与al)或a2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码氨基酸 序列为SEQ ID No. 1的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
[0019] a4)在严格条件下与al)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为SEQ ID No. 1的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
[0020] 其中，SEQ ID No. 2由1626个核苷酸组成，SEQ ID No. 2的第8-13位核苷酸为 Nde I的识别位点，SEQ ID No. 2的第14-1618位核苷酸编码SEQ ID No. 1的蛋白质，SEQ ID No. 2的第1619-1624位核苷酸为EcoR I的识别位点。
[0021 ] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的编码SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75%或更高， 或85 %或更高，或90 %或更高，或95 %或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或 计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％) 表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0022] 上述方法中，所述严格条件是在2XSSC，0. 1 % SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗 膜2次，每次5min，又于0. 5XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每次 15min〇
[0023] 上述75%或75%以上同一性，可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0024] 上述方法中，将所述蛋白质的编码基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌中为将包含 所述RFRP的编码基因的表达载体导入所述作为宿主菌的利迪链霉菌中。
[0025] 上述方法中，所述将蛋白质的编码基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌包括如下步 骤：将所述表达载体导入大肠杆菌中得到重组大肠杆菌，再将所述重组大肠杆菌与所述作 为宿主菌的利迪链霉菌进行双亲接合获得重组利迪链霉菌。
[0026] 在本发明的实施例中，所述表达载体的构建步骤包括：用SEQ ID No. 2的第 14-1618位核苷酸所示的DNA分子替换pIB139中的Nde I和EcoR I识别序列间的DNA片段 得到的重组载体PIB139-RFRP。所述pIB139-RFRP中，RFRP基因的表达由所述pIB139-RFRP 中的红霉素启动子（ermE*)启动，表达SEQ ID No. 1的所示的蛋白质。所述pIB139-RFRP 即为包含所述RFRP的编码基因的表达载体。
[0027] 上述方法中，所述作为宿主菌的利迪链霉菌可为保藏编号为CGMCC 1^〇.1653的利迪链霉菌（51:代。1:〇1115^68 17(1;[(3118)401。所述大肠杆菌可为去甲基化 E. coliET12567(pUZ8002)0
[0028] 为解决上述技术问题，本发明还提供了重组利迪链霉菌。
[0029] 本发明所提供的重组利迪链霉菌，为由所述方法得到的重组利迪链霉菌。
[0030] 上述重组利迪链霉菌中，所述重组利迪链霉菌可为含有SEQ IDNo.2的第14-1618 位核苷酸所示的DNA片段的重组利迪链霉菌。所述重组利迪链霉菌具体可为含有所述 PIB139-RFRP的重组利迪链霉菌。
[0031] 上述重组利迪链霉菌中，所述重组利迪链霉菌的菌株号为AB01，其在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 10707。
[0032] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述HI或H2的产品：
[0033] HURFRP；
[0034] H2、与RFRP相关的生物材料，为下述A1)至A20)中的任一种：
[0035] A1)编码RFRP的核酸分子；
[0036] A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
[0037] A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
[0038] A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
[0039] A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
[0040] A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
[0041] A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
[0042] A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
[0043] A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物或动物细胞系；
[0044] A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物或动物细胞系；
[0045] All)含有A3)所述重组载体的转基因植物或动物细胞系；
[0046] A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物或动物细胞系；
[0047] A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物或动物组织；
[0048] A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物或动物组织；
[0049] A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物或动物组织；
[0050] A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物或动物组织；
[0051] A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物或动物器官；
[0052] A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物或动物器官；
[0053] A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物或动物器官；
[0054] A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物或动物器官。
[0055] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也 可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0056]本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码RFRP的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分 离得到的RFRP的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要编码RFRP且具有相同功 能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0057] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相