t10,c12-共轭亚油酸工程菌株及其重组表达质粒与构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其是tlO，C12-共辄亚油酸工程菌株及其重组表达 质粒与构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 共辄亚油酸（conjugated linoleic acid，CLA)是由必需脂肪酸-亚油酸 (linoleic acid，LA)衍生的共辄双烯酸的多种位置和几何异构体的总称，具有抗癌、降脂、 调节免疫、抗粥样硬化等重要的生理功能，是近几年发展起来的一种新型的的食品功能性 油脂，其中，tlO，cl2-CLA是最具生理活性的异构体之一。自1987年美国威斯康辛营养研 究所的Ha等在研究烤牛肉过程中诱变剂的形成时发现共辄亚油酸具有抗癌特性后，引起 了人们的极大关注，目前CLA已广泛应用于药品、保健品、功能食品和食品防腐剂等领域。
[0003] 天然CLA主要存在于牛奶、羊奶、牛肉等瘤胃动物来源的食品中，但含量很少。随 着人们对健康饮食的重视，CLA的需求不断增加，高纯度CLA的大量生产势在必行。目前， 工业生产上利用化学异构法制备可食用的达到营养要求的共辄亚油酸产品很困难，且成本 高、价格昂贵，而利用生物技术方法（即亚油酸异构酶转化法）生产CLA产品，可以很好的 解决化学法生产中的问题，具有转化率高、发酵周期短、产品安全稳定等优点。亚油酸异构 酶（Conjugated linoleic acid isomerase，EC 5. 2. 1. 5)是能特异的催化亚油酸转化为 CLA的一类酶，该酶主要存在于一些能合成CLA的微生物细胞中，近年来大量工作围绕亚油 酸异构酶克隆表达展开，特别是疮疱丙酸杆菌（Propionibacterium acnes)中亚油酸异构 酶基因（pai)因其可溶性和高催化活性成为异源表达的首选。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种tlO, cl2_共辄亚油酸工程菌株所含的 重组表达质粒。
[0005] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述tlO, cl2_共辄亚油酸工程菌株。
[0006] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述tlO, cl2_共辄亚油酸工程菌株的 构建方法。
[0007] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述tlO, cl2_共辄亚油酸工程菌株的 应用。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0009] -种tlO, cl2_共辄亚油酸工程菌株所含的重组表达质粒，为含有亚油酸异构酶 基因pai的重组表达质粒，该亚油酸异构酶基因pai插入载体pFGL59-PgpdA_Ttrpc中，即 所述重组表达质粒包括启动子PgpdA、亚油酸异构酶基因pai和终止子Ttrpc的真菌表达载 体pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc，所述启动子PgpdA的序列为序列表〈400>1所示序列，所述亚 油酸异构酶基因pai的序列为序列表〈400>3所示序列，所述终止子Ttrpc的序列为序列表 〈400>2所示序列，所述pFGL59的序列为序列表〈400>4所示序列。
[0010] 一种tio, C12-共辄亚油酸工程菌株，含有上述重组表达质粒，所述工程菌的宿 主菌为拉曼被孢霉，所述拉曼被孢霉的保藏号为G頂3. 244 (购买自广东微生物菌种保藏 中心），该工程菌株为 M. ramanniana-pFGL59-PgpdA-pai_Ttrpc，其保藏号为 CGMCC N0. 10761。
[0011] 上述tlO, cl2-共辄亚油酸工程菌株的构建方法，具体步骤为：将构建含有启动子 PgpdA、基因pai和终止子Ttrpc的真菌表达载体pFGL59-PgpdA_Ttrpc先电转化进农杆菌 (农杆菌编号为AGL-1)，再通过所述农杆菌的介导转化，利用拉曼被孢霉工程菌株孢子在 含有潮霉素的PDA平板上筛选转化子，潮霉素终浓度500ug/ml，通过PCR方法来验证表达 载体pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc是否成功插入到拉曼被孢霉基因组中。
[0012] 优选的，上述tio,C12-共辄亚油酸工程菌株的构建方法，所述农杆菌的介导转化 方法为：共培养温度为28°C，共培养72h，拉曼被孢霉孢子浓度为1 X 1〇7 y L，农杆菌培养 诱导后菌体的〇D6。。为0. 8,且拉曼被孢霉与农杆菌的孢子数比为2:1。
[0013] 优选的，上述tl0，cl2_共辄亚油酸工程菌株的构建方法，所述拉曼被孢霉工程菌 株孢子接种到PDA平板上的方法为：28°C黑暗培养4-5d，将孢子洗下后将孢子浓度调整到 1 X 10s/ y L并接种到种子培养基，28°C、200rpm培养24h，按10%接种量接种到发酵培养基 中28°C、200rpm发酵培养5d。
[0014] 优选的，上述tlO, cl2-共辄亚油酸工程菌株的构建方法，所述种子培养基按g/L 计为：葡萄糖 30,酵母膏 6, KH2P042, MgS04 ? 7H200. 5, NaN032, PH = 6. 0,121°C灭菌 20min。
[0015] 优选的，上述tlO, cl2-共辄亚油酸工程菌株的构建方法，所述发酵培养基按g/L 计为：葡萄糖50,酵母浸出物10，KH2P042，MgS0 4 = 6. 0,121°C灭菌20min，其中葡 萄糖配制50%，115°C灭菌20min，发酵培养条件：发酵培养基中28°C、200rpm发酵培养5d。
[0016] 上述tlO, cl2-共辄亚油酸工程菌株在生产tlO, cl2-共辄亚油酸方面的应用。
[0017] 优选的，上述tio, C12-共辄亚油酸工程菌株的应用，具体为：直接利用拉曼被孢 霉内源底物亚油酸作为催化底物，一步法合成tlO, cl2-共辄亚油酸，降低生产成本。
[0018] 本发明的有益效果是：
[0019] 1、本发明将来源于痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes)的亚油酸异构酶基 因 pai 插入载体 pFGL59-PgpdA_Ttrpc 中，构建了表达载体 pFGL59-PgpdA-pai_Ttrpc，并将 它导入拉曼被孢霉G頂3. 244中，获得含有表达载体pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc的拉曼被 孢霉工程菌株M. ramanniana-pFGL59-PgpdA-pai_Ttrpc，该工程菌株经发酵培养后，通过气 相色谱在菌丝体中能检测到单一活性异构体tlO, C12-CLA。
[0020] 2、本发明首次建立和优化了产油霉菌拉曼被孢霉的遗传转化系统并在其中异源 表达了亚油酸异构酶，使得对拉曼被孢霉进行遗传改造成为可能，丰富了被孢霉属的遗传 工具。
[0021] 3、本发明能产生单一异构体tlO, cl2-CLA，无论对于将来CLA用于临床药物试验 还是膳食添加不同CLA异构体的合理配比，单一异构体的大量合成为共辄亚油酸在医学和 营养学上功能的应用奠定了重要基础。
[0022] 4、本发明中使用的产油霉菌-拉曼被孢霉（Mortierela ramanniana)能产生多 种不饱和脂肪酸，在以葡萄糖为主要碳源的培养基中，发酵产生的油脂含量占菌体干重的 39. 547%，其中亚油酸的含量为3. 25g/L (图5,具体测量方法见实施例3)，是工业化生产微 生物油脂的最适宜的出发菌株。采用基因过表达及基因整合技术，通过农杆菌介导途径，将 来源于痤疮丙酸杆菌中的亚油酸异构酶基因导入到亚油酸的优质产生菌拉曼被孢霉中，使 其在真菌特有的组成型启动子的控制下高效表达，一步法催化合成CLA，提高LA到CLA的转 化效率，能进一步降低CLA生产成本，对微生物发酵法合成CLA具有很大的推动作用。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明真菌整合型表达载体pFGL59-PgpdA-pai_Ttrpc的结构示意图：亚 油酸异构酶编码基因pai在强启动子PgpdA的作用下高效表达。
[0024] 图2为本发明将真菌表达载体pFGL59-PgpdA-pai_Ttrpc转入M. ramanniana的得 到的转化子：筛选平板长出的转化子与共培养所用孢子数的比例即转化率为3*10 5。
[0025]图3为本发明拉曼被孢霉遗传转化体系的优化，其中，图3-1至图3-3为三个主 要影响因素包括共培养温度、共培养时间及拉曼被孢霉孢子与农杆菌的比例。结果表明：共 培养温度为28°C，最优共培养时间72h，拉曼被孢霉孢子浓度为1 X 107,农杆菌培养诱导后 菌体的〇D6。。为0. 8,且二者混合比例2:1是最优混合比例。
[0026] 图4为本发明真菌整合型表达载体pFGL59-PgpdA-pai_Ttrpc转化拉曼被孢霉的 转化子PCR验证电泳图：随机挑取的10个转化子全部能扩增出大小为1275bp的特异条带 (其中1号转化子条带较弱），结果表明均为阳性转化子。
[0027] 图5为本发明重组工程菌株M. ramanniana-pFGL59-PgpdA-pai_Ttrpc发酵产物的 气相色谱图：结果表明与野生株相比，重组菌株能成功合成tlO, C12-CLA单一活性异构体。
[0028] 图6为气相色谱检测到的重组菌株发酵产物中tlO, C12-CLA的质谱图：进一步确 定了气相图中与标品出峰时间一致的峰为tlO, C12-CLA。
[0029] 保藏信息
[0030]分类名词：拉曼被抱霉（Mortierele ramenniana)
[0031] 保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0032] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0033] 保藏日期：2015年4月23日
[0034]保藏号：CGMCCN0.10761
【具体实施方式】
[0035] 下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
[0036] 实施例中
[0037] -、构建含有启动子PgpdA、基因pai和终止子Ttrpc真菌表达载体 pFGL59-PgpdA-Ttrpc ；
[0038] 二、构建含有真菌表达载体pFGL59-PgpdA-Ttrpc拉曼被孢霉工程菌株，拉曼被孢 霉的保藏号为：GIM 3. 244,本发明实用的拉曼被孢霉不仅限于该菌株，所有拉曼被孢霉均 能够实现本发明；
[0039] 三、含有真菌表达载体pFGL59-PgpdA-Ttrpc拉曼被孢霉工程菌株表达异源基因 生产tlO, C12-CLA，将基因工程菌株孢子接种到发酵培养基，28°C、200rpm震荡培养5-7天， 发酵结束后真空抽滤收集菌体，50°C条件下烘干。
[0040] 具体论述如下：
[0041] 本发明所述的启动子Pgp