一种冬虫夏草固体发酵液中多糖的提取方法
【专利说明】一种冬虫夏草固体发酵液中多糖的提取方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种冬虫夏草固体发酵液中多糖的提取方法。
【背景技术】
[0003]冬虫夏草是麦角菌科真菌，它寄生于虫草蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体上。冬虫夏草首载于本草从新，味甘，性温，归肺，肾经，具有具有多种生理活性，如补虚损、益精气、保肺、益肾、止血化痰、滋补强壮、抗氧化、提高免疫力等，因此，常用来治疗劳咳痰血、盗汗、阳痿、遗精、黄胆病、肺结核及老年衰弱、慢性咳喘等症。一直以来，冬虫夏草一直被视为珍贵的中药材。
[0004]虫草多糖是虫草中含量最高的生物活性物质，具有抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力、降低血脂等广泛的药理作用，目前，市面上的“金水宝胶囊”、“宁心宝胶囊”、“虫草菌胶囊”、“百令胶囊”等产品中起主要作用的就是虫草多糖。但由于冬虫夏草对生长环境要求较高，自然野生的产量相当有限，为此，如何对对冬虫夏草中的多糖活性成分进行高效提取，是目前国内外学者研究的热点。现有的冬虫夏草多糖提取技术主要包括超声波法、水提醇沉法及超临界二氧化碳萃取法，但上述方法存在各自的缺陷或不足，例如水提醇沉法提取率低，多糖纯度不足。为此，本发明提供一种改进的冬虫夏草胞内多糖提取方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是解决现有技术中存在的上述问题，提供一种冬虫夏草固体发酵液中多糖的提取方法，多糖得率高，操作简便。
[0006]本发明的技术方案如下:
一种冬虫夏草固体发酵液中多糖的提取方法，包括以下步骤:
(1)样品前处理:将保藏好的冬虫夏草菌种5-10g经清水冲洗、烘干后，备用；
(2)配制固体发酵培养基:取葡萄糖2-5g，玉米粉2-4g，氮源l-2g，麦麸2-4g，KH2PO4
2-4g, MgSO4 l_2g，Vitamin B1 2_4g，Vitamin B2 3_6g，培养基中加入蒸馈水，加热煮沸，调节PH，趁热倒入容器中，高压蒸汽灭菌，倒在平板上；
(3)发酵培养:将步骤(I)中经样品前处理后的样品接种到步骤(I)中制备好的培养基中，培养完成后取菌种发酵液备用；
(4)取步骤(3)中制得的菌种发酵液加水进行超声回流提取，经0.45um微孔滤膜过滤，取样品滤液备用；
(5)将步骤(4)中制备的样品滤液蒸发浓缩至原体积的1/3-1/2，再加乙醇进行醇沉，经过滤后，冷冻离心，取上清液在4°C条件下静置12h，在常温下离心，经0.45um微孔滤膜过滤得沉淀，采用无水乙醇洗涤1-3次，浓缩得到样品粗多糖； (6)将步骤(5)中制得的样品粗多糖采用添加活性碳的沸水溶解脱色，冷却，再加沸水，再冷却，去除蛋白，将去除蛋白的样品溶液置入透析袋中，在蒸馏水中透析24h，将5-10倍体积的乙醇加入透析后的溶液中，在4°C条件下沉淀过夜，离心，弃上清，取沉淀物干燥，制得精多糖。
[0007]优选的，步骤(I)与步骤(6)中所述的烘干温度均为50_80°C。
[0008]优选的，步骤(2)中加蒸馏水的量是按料水比(1-3): (1.5-5)的体积加入的。
[0009]优选的，步骤(2)中调节PH为调节PH至6.5-7.2。
[0010]优选的，步骤(2)中所述的高压蒸汽灭菌时间为10_20min。
[0011]优选的，步骤(3)中所述的培养温度为25_28°C，培养为无光照培养，培养时间为5-7do
[0012]优选的，步骤(4)中所述的超声回流提取温度为80-100°C，提取时间为每次l_2h，提取次数为3-5次。
[0013]优选的，步骤(5)中所述的冷冻离心温度为-10- _4°C，步骤(5)中两次离心及步骤(6)中的离心速度均为4000-8000r/min，离心时间均为10_20min。
[0014]优选的，步骤(6)中所述的添加活性碳的沸水中，活性碳的质量浓度为1_3%。
[0015]优选的，步骤(6)中所述的透析膜为截留分子量为6000-8000的半透膜，所述的乙醇浓度为65-80%。
[0016]本发明与现有技术相比，有益效果体现在:
1.氮源是虫草菌生长所必需的营养元素，由于虫草菌在原寄主蝙蝠蛾幼虫体内长期寄生，已适应对动物类蛋白的吸收利用，而对植物类蛋白吸收较差，导致其有效成分的含量及生物量低于动物氮源。因此，本发明中将蛋白胨或蚕蛹粉等作为固态培养基的氮源，可提高虫草菌丝体及其主要有效成分的含量
2.本发明对固态培养基的成分进行了严格优化，对固态培养时的培养温度、料水比及光照等培养条件也进行了严格控制，对冬虫夏草菌丝体生长更有利，可明显提高菌丝体中的主要有效成分之一麦留醇的含量。
[0017]3.多糖类成分的提取常采用热水、溶剂(酸、碱或乙醇)浸提法，本发明先将样品进行预处理，将样品发酵液进行浓缩，加乙醇进行精制，且将乙醇浓度限制为65-80%，可使冬虫夏草胞外多糖醇沉效果最好。
[0018]4.冬虫夏草发酵液中的蛋白质会影响其中多糖的是率及含量测定，因此，在虫草多糖提取过程中，常需要采取措施去除其中的蛋白质，研究显示，sevage法清除蛋白质效果最好，且多糖得率也最高，但因氯仿毒性较大，因此，不适宜冬虫夏草的实际生产应用，而三氯乙酸法多糖得率低，且脱蛋白效果也不明显，为此，本发明采用添加有一定浓度的活性碳沸水脱色后，加热、冷却法去除蛋白，操作简便，效果好，且不影响多糖的多率。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明:
实施例1
一种冬虫夏草固体发酵液中多糖的提取方法，包括以下步骤:
(I)样品前处理:将保藏好的冬虫夏草菌种5g经清水冲洗、在50°C下烘干后，备用； (2)配制固体发酵培养基:取葡萄糖2g，玉米粉2g，氮源lg，麦麸2g，KH2PO4 2g，MgSO4lg，Vitamin B1 2g，Vitamin B2 3g，培养基中加入蒸馈水，加热煮沸，调节PH至6.5，趁热倒入容器中，高压蒸汽灭菌lOmin，倒在平板上；
(3)发酵培养:将步骤(I)中经样品前处理后的样品接种到步骤(I)中制备好的培养基中，培养温度为25°C，培养为无光照培养，培养时间为5d，培养完成后取菌种发酵液备用；
(4)取步骤(3)中制得的菌种发酵液加水在80°C下进行超声回流提取3次，每次lh，经
0.45um微孔滤膜过滤，取样品滤液备用；
(5)将步骤(4)中制备的样品滤液蒸发浓缩至原体积的1/3，再加乙醇进行醇沉，经过滤后，在-10°C以4000r/min冷冻离心lOmin，取上清液在4°C条件下静置12h，在常温下以4000r/min离心lOmin，经0.45um微孔滤膜过滤得沉淀，采用无水乙醇洗涤I次，浓缩得到样品粗多糖；
(6)将步骤(5)中制得的样品粗多糖采用添加1%活性碳的沸水溶解脱色，冷却，再加沸水，再冷却，去除蛋白，将去除蛋白的样品溶液置入透析袋中，在蒸馏水中透析24h，将5倍体积的65%乙醇加入透析后的溶液中，在4°C条件下沉淀过夜，离心，弃上清，取沉淀物干燥，制得精多糖。
[0020]步骤(2)中加蒸馏水的量是按料水比1: 1.5的体积加入的。
[0021]步骤(6)中所述的透析膜为截留分子量为6000的半透膜。
[0022]
实施例2
一种冬虫夏草固体发酵液中多糖的提取方法，包括以下步骤:
(1)样品前处理:将保藏好的冬虫夏草菌种1g经清水冲洗、在80°C下烘干后，备用；<