一种蛹虫草液体培养基及蛹虫草的培养方法
【专利说明】一种蛹虫草液体培养基及蛹虫草的培养方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛹虫草液体培养基及蛹虫草的培养方法。
【背景技术】
[0003]蛹虫草(Cordyceps militaris)又名北冬虫夏草，隶属于子囊菌门Ascomycota奚壳菌纲 Sordar1mycetes，肉座菌目 Hypocreales，虫草科 Cordycipitaceae，虫草属Cordyceps，是虫草属的模式种。野生蛹虫草主要寄生于针叶林、阔叶林或混交林地表土层中的鳞翅目昆虫的蛹体上，也有发现寄生于鞘翅目和双翅目等昆虫的蛹、成虫或幼虫体上。蛹虫草含有多种生物活性物质，包括虫草素、腺苷等核苷类物质、还包括虫草多糖、SOD(超氧化物歧化酶)及氨基酸等，而其中最主要的活性成分为虫草素，研究表明虫草素具有调节免疫、抗肿瘤、抗真菌、抗白血病、降血脂等多种药理活性，因此，市场需求越来越大。
[0004]虫草素在蛹虫草中的含量极低，虽然虫草素可通过化学合成，但合成工艺复杂，产物回收率低，生产成本高，因此，目前研究最多的还是如何通过蛹虫草发酵获得虫草素，但是如何优化蛹虫草的培养条件，提高蛹虫草生长及其中虫草素的含量一直是备受关注的问题。本发明提供一种蛹虫草液态深层培养方法，可快速生产蛹虫草，同时还可提高其虫草素的产量。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是解决现有技术中存在的上述问题，提供一种蛹虫草液体培养基，操作简便，且虫草素产量高。
[0006]本发明的技术方案如下:
一种蛹虫草液体培养基，所述的培养基包括由以下含量的各组分组成:
KH2P04l_3g/L，
MgS04l_3g/L，
氮源5-20g/L，
马铃薯200-500g/L，
D-果糖8-15 g/L，
琼脂20-50 g/L,
碱性氨基酸10-25 g/L,
酸性氨基酸8-20 g/L,
蚕蛹粉30-50g/L。
[0007]优选的，所述的氮源选自蛋白胨、牛肉膏或酵母膏中的一种或多种。
[0008]优选的，所述的蛋白胨的浓度为7.5-15g/L0
[0009]优选的，所述的D-果糖的浓度为10-12 g/L ο
[0010]优选的，所述的碱性氨基酸选自精氨酸、赖氨酸或组氨酸中的一种或多种。
[0011 ] 优选的，所述的酸性氨基酸选自谷氨酸或天冬氨酸中的一种或多种。
[0012]优选的，所述的培养基的PH为5-8。
[0013]采用如上所述的蛹虫草液体培养基进行蛹虫草培养的方法，包括以下步骤:
(1)摇瓶培养:按KH2P04 l_3g/L、MgS04 l_3g/L、氮源 5_20g/L、马铃薯 200_500g/L、D-果糖8-15 g/L、琼脂20-50 g/L、碱性氨基酸10-25 g/L、酸性氨基酸8-20 g/L、蚕蛹粉30-50g/L的基础培养基配方进行配养基配制，高压蒸汽灭菌10-30min，在常温下冷却后，装于500ml的广口瓶中，接种蛹虫草菌种后，在无光照且培养温度为25-28°C下，以150-200r/min摇瓶培养7_10d得到发酵液；
(2)虫草素含量测定:步骤(I)中的培养结束后的发酵液，以3000-5000r/min离心10-30min，收集上清液，加水稀释，经0.45um滤膜过滤，取滤液采用HPLC法测定虫草素的含量。
[0014]优选的，步骤(I)中所述的接种的蛹虫草菌种与培养基的体积比为1:(30_50)。
[0015]优选的，步骤(I)中在培养第4d时，加入腺嘌呤l_3g/L及甘氨酸16-40g/L。
[0016]本发明与现有技术相比，有益效果体现在:
1.蛹虫草生长过程中98%的虫草素分泌到培养基中，而从培养液中提取虫草素，不仅提取方便，而且生产周期短，采用本发明中的液体培养基对蛹虫草进行液态深层培养，可明显提高蛹虫草虫草素的含量。
[0017]2.本发明采用D-果糖作为培养基中的碳源，其可明显提高虫草素的含量，明显高于其他碳源(葡萄糖、淀粉、乳糖及纤维素等)；本发明将蛋白胨、牛肉膏或酵母膏三种有机氮源作为培养基的氮源，也可明显提高虫草素的产量。
[0018]3.氨基酸是构成蛋白质的基本成分，并与真菌的生命活动关系密切，国外学者研究显示，在蛹虫草培养时，添加一定量的甘氨酸、天冬氨酸等氨基酸时，可使蛹虫草中的虫草素含量明显增加，本发明选择对蛹虫草虫草素生长促进作用最强的三种碱性氨基酸及两种酸性氨基酸，将其以一定比例添加于基础培养基中，可显示提高蛹虫草虫草素的产量。
[0019]4.腺嘌呤及甘氨酸是虫草素合成的前体物质，本发明在发酵培养第4d时，在培养基中添加了这两种前体物质，蛹虫草可直接利用这两种物质合成虫草素，因此，也可显著增加蛹虫草虫草素的产量。
【具体实施方式】
[0020]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明:
实施例1
一种蛹虫草液体培养基，所述的培养基包括由以下含量的各组分组成:
KH2P04Ig/L,
MgS04Ig/L,
蛋白胨5g/L，
马铃薯200g/L，
D-果糖8 g/L, 琼脂20 g/L,
精氨酸10 g/L,
谷氨酸8 g/L,
蚕蛹粉30g/L。
[0021]所述的培养基的PH为5。
[0022]采用如上所述的蛹虫草液体培养基进行蛹虫草培养的方法，包括以下步骤:
(1)摇瓶培养:按KH2P04 lg/L、MgS04 lg/L、蛋白胨 5g/L、马铃薯 200g/L、D_ 果糖 8g/L、琼脂20 g/L、精氨酸10 g/L、谷氨酸8 g/L、蚕蛹粉30g/L的基础培养基配方进行配养基配制，高压蒸汽灭菌lOmin，在常温下冷却后，装于500ml的广口瓶中，按蛹虫草菌种与培养基的体积比为1:30的量接种后，在无光照且培养温度为25°C下，以150r/min摇瓶培养7d得到发酵液；
(2)虫草素含量测定:步骤(I)中的培养结束后的发酵液，以3000r/min离心lOmin，收集上清液，加水稀释，经0.45um滤膜过滤，取滤液采用HPLC法测定虫草素的含量。
[0023]步骤(I)中在培养第4d时，加入腺嘌呤lg/L及甘氨酸16g/L。
[0024]
实施例2
一种蛹虫草液体培养基，所述的培养基包括由以下含量的各组分组成:
KH2P043g/L,
MgS043g/L，
牛肉膏20g/L，
马铃薯500g/L，
D-果糖15 g/L,
琼脂50 g/L,
赖氨酸25 g/L,
天冬氨酸20 g/L,
蚕蛹粉50g/L。
[0025]所述的培养基的PH为8。
[0026]采用如上所述的蛹虫草液体培养基进行蛹虫草培养的方法，包括以下步骤:
(1)摇瓶培养-MKH2P04 3g/L、MgS04 3g/L、牛肉膏 20g/L、马铃薯 500g/L、D_ 果糖 15g/L、琼脂50 g/L、赖氨酸25 g/L、天冬氨酸20 g/L、蚕蛹粉50g/L的基础培养基配方进行配养基配制，高压蒸汽灭菌30min，在常温下冷却后，装于500ml的广口瓶中，按蛹虫草菌种与培养基的体积比为1:50接种蛹虫草菌种后，在无光照且培养温度为28°C下，以200r/min摇瓶培养1d得到发酵液；
(2)虫草素含量测定:步骤(I)中的培养结束后的发酵液，以5000r/min离心30min，收集上清液，加水稀释，经0.45um滤膜过滤，取滤液采用HPLC法测定虫草素的含量。
[0027]步骤(I)中在培养第4d时，加入腺嘌呤3g/L及甘氨酸40g/L。
[0028]
实施例3
一种蛹虫草液体培养基，所述的培养基包括由以下含量的各组分组成: KH2P042g/L，
MgS042g/L，
蛋白胨15g/L，
马铃薯350g/L，
D-果糖12 g/L,
琼脂35 g/L,
组氨酸18 g/L,
谷氨酸15 g/L,
蚕蛹粉45g/L。
[0029]所述的培养基的PH为7。
[0030]采用如上所述的蛹虫草液体培养基进行蛹虫草培养的方法，包括以下步骤:
(O摇瓶培养:按KH2P04 2g/L、MgS04 2g/L、蛋白胨15g/L、马铃薯350g/L、D-果糖12g/L、琼脂35g/L、组氨酸18 g/L、谷氨酸15 g/L、蚕蛹粉45g/L的基础培养基配方进行配养基配制，高压蒸汽灭菌20min，在常温下冷却后，装于500ml的广口瓶中，按蛹虫草菌种与培养基的体积比为1:40接种蛹虫草菌种后，在无光照且培养温度为26°C下，以180r/min摇瓶培养Sd得到发酵液；
(2)虫草素含量测定:步骤(I)中的培养结束后的发酵液，以4000r/min离心20min，收集上清液，加水稀释，经0.45um滤膜过滤，取滤液采用HPLC法测定虫草素的含量。
[0031]步骤(I)中在培养第4d时，加入腺嘌呤2g/L及甘氨酸25g/L。
[0032]
上述实施例仅为本发明的优选实施方式，并不应理解为对本发明的限定，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种蛹虫草液体培养基，其特征在于，所述的培养基包括由以下含量的各组分组成: KH2P04l_3g/L， MgS04l_3g/L， 氮源5-20g/L， 马铃薯200-500g/L， D-果糖8-15 g/L， 琼脂20-50 g/L, 碱性氨基酸10-25 g/L, 酸性氨基酸8-20 g/L, 蚕蛹粉30-50g/L。2.根据权利要求1所述的所述的一种蛹虫草液体培养基，其特征在于，所述的氮源选自蛋白胨、牛肉膏或酵母膏中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的所述的一种蛹虫草液体培养基，其特征在于，所述的蛋白胨的浓度为7.5-15g/L04.根据权利要求1所述的所述的一种蛹虫草液体培养基，其特征在于，所述的D-果糖的浓度为10-12 g/L ο5.根据权利要求1所述的所述的一种蛹虫草液体培养基，其特征在于，所述的碱性氨基酸选自精氨酸、赖氨酸或组氨酸中的一种或多种。6.根据权利要求1所述的所述的一种蛹虫草液体培养基，其特征在于，所述的酸性氨基酸选自谷氨酸或天冬氨酸中的一种或多种。7.根据权利要求1所述的所述的一种蛹虫草液体培养基，其特征在于，所述的培养基的PH为5-8。8.采用如权利要求1~7任一所述的蛹虫草液体培养基进行蛹虫草培养的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)摇瓶培养:按KH2P04 l_3g/L、MgS04 l_3g/L、氮源 5_20g/L、马铃薯 200_500g/L、D-果糖8-15 g/L、琼脂20-50 g/L、碱性氨基酸10-25 g/L、酸性氨基酸8-20 g/L、蚕蛹粉30-50g/L的基础培养基配方进行配养基配制，高压蒸汽灭菌10-30min，在常温下冷却后，装于500ml的广口瓶中，接种蛹虫草菌种后，在无光照且培养温度为25-28°C下，以150-200r/min摇瓶培养7_10d得到发酵液； (2)虫草素含量测定:步骤(I)中的培养结束后的发酵液，以3000-5000r/min离心10-30min，收集上清液，加水稀释，经0.45um滤膜过滤，取滤液采用HPLC法测定虫草素的含量。9.根据权利要求8所述的蛹虫草培养的方法，其特征在于，步骤(I)中所述的接种的蛹虫草菌种与培养基的体积比为1: (30-50)。10.根据权利要求8所述的蛹虫草培养的方法，其特征在于，步骤(I)中在培养第4d时，加入腺嘌l_3g/L及甘氨酸16-40g/L。
【专利摘要】本发明涉及一种蛹虫草液体培养基，所述的培养基包括由以下含量的各组分组成：KH2PO4？1-3g/L，MgSO4？1-3g/L，氮源5-20g/L，马铃薯200-500g/L，D-果糖8-15？g/L，琼脂20-50？g/L，碱性氨基酸10-25？g/L，酸性氨基酸8-20？g/L，蚕蛹粉30-50g/L。所述的液体培养基将碳源限定为D-果糖，培养基中还添加碱性氨基酸及酸性氨基酸，采用该液体培养基进行蛹虫草的培养，可明显提高蛹虫草的产量，也可显著提高其中虫草素的产量，生产周期短，而且后续虫草素提取分离方便，适于工业化大生产。
【IPC分类】C12P19/40, C12R1/645
【公开号】CN105039467
【申请号】CN201510356495
【发明人】郭狄
【申请人】中山鼎晟生物科技有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月25日