检测稻瘟病抗性与氮肥响应的表达型分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及稻瘟病相关研究领域，特别涉及一种检测稻瘟病抗性与氮肥响应的表 达型分子标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 氮素是植物主要的营养元素，对于正常生长发育必不可少，氮素的供应水平对水 稻根系的生长形态、解剖结构，尤其是对化学组成的影响最为明显。已有研究表明，品种的 抗病性受氮肥量影响较大，氮肥量越多发病越重，增施氮肥显著增加水稻叶瘟和穗颈瘟的 发生程度，尤其是抗瘟性往往首先出现在氮肥施用量大的稻田，虽然抗性丧失的程度和快 慢还受其它因素的影响，某些敏感品种，在高氮肥条件下，较其它品种更易丧失抗性，由于 抗病性降低，病菌种群数量增大，新小种较易被发现；另外，抗病性降低程度依小种而异，BP 某些小种在高氮肥条件下更易增值；再者，抗病性降低程度因品种-小种组合而异，即某些 组合在同一氮肥水平情况下，比其它组合更感病。许多研究学者都已注意到，稻瘟病的发生 及其严重程度与水稻植株中氮的含量有关。在环境因素相同的条件下，植株中氮含量越高， 稻瘟病病害越重。D. H. Long等通过两年大田试验，研究不同的氮肥水平和施氮方式对不同 水稻品种稻瘟病的影响认为，少量频施氮肥可减少叶瘟的发生。任金平等的研究也发现，在 稻瘟病得到有效控制情况下，产量随着施氮量的增加而提高，但在稻瘟病未得到有效控制 的情况下，随着施氮量的增加，稻瘟病加重，产量降低。赵美琦等在研究水稻品种-稻瘟病 小种相对寄生适度时注意到：氮肥施用量对水稻各品种与稻瘟菌小种组合的接种发病程度 影响很大。
[0003] 现有研究表明，稻瘟病的发生及其严重程度与水稻植株中氮的含量有关。可能是 由于大量施氮促进植物生长，幼嫩组织增加，细胞壁变薄和强度下降，从而减低作物的抗 性，增加感病几率，从生理上看可能是由于施氮增加了质外体中氨基酸、酰胺的浓度，酶活 性和木质素含量降低所致。缺氮植物的分类化合物含量通常很高，当大量供应氮素时，酚 代谢的一些关键酶活性下降，酚含量和抗稻瘟病的能力就降低。水稻稻瘟病随施氮水平的 增加而增加，可能与具有显著抗稻瘟病病菌特性的酚类化合物和黄酮类物质的含量下降有 关。随着氮肥用量的增加，植物体内糖类、淀粉含量下降，大量使用氮肥使合成酚的关键酶 苯丙氨酸解氨酶和酪氨酸解氨酶活性降低，从而使植株总酚含量降低。在一定范围内，施氮 量增加，多酚氧化酶活性降低，抗病能力减弱，易遭受病虫害侵袭]。
[0004]虽然目前对稻瘟病的发生与氮肥使用量之间关系的研究已经很多。但是，目前尚 缺乏有效检测水稻稻瘟病抗与性氮肥施用量之间关系的有效方法和手段。
【发明内容】
[0005] 为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测稻瘟病抗性与 氮肥响应的表达型分子标记，可用于高效快速检测氮肥的施用量对稻瘟病抗性的影响。
[0006] 为达到上述目的，本发明的技术方案为：
[0007] -种检测稻瘟病抗性与氮肥响应的表达型分子标记，根据与氮诱导蛋白相关的基 因0s04g0379600序列设计了一种检测稻瘟病抗性与氮肥响应的表达型分子标记Mg-N-1， 该分子标记参考的0s04g0379600基因的DNA核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0008] 进一步的，以SEQID NO: 1序列为基础，利用Primer design设计的跨一个内含子 的特异分子标记Mg-N-1，Mg-N-1标记的正反引物序列为：
[0009]正向引物（5，-3'）GCTAATGGCACAACCTGACA
[0010]反向引物（5，-3'）TAGGAGTATGCTGGCCATGT。
[0011] 进一步的，上述基因及引物在检测稻瘟病抗性与氮肥响应的表达型方面的应用。
[0012] 相对于现有技术，本发明的有益效果为：
[0013] 本发明一种检测稻瘟病抗性与氮肥响应的表达型分子标记，可用于高效快速检测 氮肥的施用量对稻瘟病抗性的影响。
【附图说明】
[0014] 图1该基因表达的电泳图。
[0015] 其中，1和2为用DNA样品进行扩增的电泳图，3和4为用cDNA样品进行扩增的 电泳图，M 为 ladder markerDL-2000,分子量标记从小到大为 100bp，250bp，500bp，750bp， lOOObp 和 2000bp。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明技术方案做进一步详细描述：
[0017]1.样品的采集及总RNA的提取
[0018] 当水稻生长至3. 5叶期时，用稻瘟病菌接种水稻，并在接种后的0h，12h，24h，36h 和48h采集样品，将取下的样品迅速放入液氮中，防止RNA降解；研磨样品时将研钵置于冰 盒中用液氮将研钵冷却后，取出液氮保存的样品，用研棒将样品磨细，研磨过程中要保证钵 内的温度，不断向钵中加入液氮，待样品磨细后，静止片刻待样品略干时，将磨好样品立即 放入装有lml TRAZ0L提取液的Eppendorf管中（样品量约三小勺尖），并剧烈震荡摇匀后 防入-20°C保存备用，整个过程中要保持样品不能被污染。
[0019] 将磨好的RNA样品放于室温下约5min，待溶解后提取RNA，其操作步骤如下：
[0020]1)将溶解的样品于4°C，10, OOOrpm下离心10min，取上清转移到无RNA酶的离心 管中。
[0021] 2)加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3min。
[0022] 3) 4°C，12, OOOrpm离心10min，取上层无色的水相（约500 y 1)转移到新管。
[0023] 4)加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min。
[0024]5) 4°C，12, OOOrpm 离心 10min，弃上清。
[0025] 6)向沉淀中加入lml 75%乙醇（DEPC处理过的水配制）4°C，9,OOOrpm离心5min， 倒出液体，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，室温放置晾干，洗涤沉淀2次。弃上 清保留沉淀后加1ML 100%乙醇同条件离心。
[0026]加入50-100 y 1无RNase的水，反复吹打、混匀，待RNA充分溶解后，利用核酸蛋白 分析仪检测RNA浓度。
[0027] 表1?供试材料
[0028]
[0029] 2. RNA样品中DNA的消化及其纯化
[0030] DNA的消化处理时各种试剂的使用量参照的是TAKARA RNase-Free DNase试剂说 明书，消化10 y g RNA样品的体系为30 y 1，加入下列组分并用无RNase的水补足体积。具 体操作步骤如下：
[0031] 1)将表1中的试剂配好（此步骤在冰上完成），混合均匀后于37°C保温30min，消 化 DNA。