红枣中链格孢菌的多重pcr检测引物及方法
【技术领域】
[0001]本发明具体涉及红枣中链格孢菌的多重PCR快速检测方法与应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]率(Zizyphus jujuba Mill)属鼠李科率属植物，是一种药食同源的食品。但红率在自然条件下贮藏容易发生真菌病害侵染引起的霉变，在霉变过程中，真菌产生的真菌毒素具有很强的毒性，会给食用者带来危害，链格孢菌是红枣霉变中的主要真菌之一，因此，对其进行快速准确的检测，对控制红枣产品的安全性具有重要意义。
[0003]传统的，链格孢菌常用分离培养和血清学方法，分别采用不同的检验程序、方法，分别报告，确诊检验结果至少需5?7d，检验方法繁琐、时间长、特异性低等，因此，快速、准确、简便的链格孢菌检测方法将是发展的方向。建立一种快速检测霉变红枣中链格孢菌的检测方法具有重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是采用枣中链格孢菌特菌Alt-FURl扩增片段和Alt_F2，R2扩增片段设计引物，采用多重PCR对其进行鉴定，旨在为枣产品的检测链格孢菌检测提供一种快速、准确、简便新方法
[0005]本发明的技术方案如下:一种枣中链格孢菌特菌多重PCR检测方法，采取如下步骤:
[0006](I)将霉变红枣上刮下的菌丝刮下、洗涤干燥，液氮研磨后转移至EP管中，使用试剂盒提取基因组DNA作为PCR反应的模板；
[0007](2)从红枣真菌菌丝中提取基因组DNA，作为PCR反应的模板，分别用Alt_Fl、Rl扩增片段和Alt-F2，R2扩增片段设计的引物进行PCR，PCR反应体系为50 μ L:DNA模板2 μ L ; 10 X 缓冲液 5 μ L ；dNTP (每种 2.5mmol/L) 2 μ L ;引物(10 μ M/L)各 2 μ L ；Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0.4 μ L ;无菌水补足至50 μ Lo PCR反应程序为:95°C预变性5min，然后94°C变性30sec，52°C退火30sec，72°C延伸40sec，35个循环，72°C延伸lOmin。反应结束后取5yL PCR产物加I yL6X溴酚蓝上样缓冲液，在2%琼脂糖凝胶上IlOV电泳35min。根据条带有无和大小判定结果。本发明的有益效果是:链格孢菌是影响红枣霉变的重要因素，霉变红枣对消费者的身体健康造成危害，而传统的链格孢菌细菌培养、血清学、生化鉴定等检测方法检测周期长(需4?7d)，操作繁琐复杂，特异性、敏感度低，不能起到有效地监测和预防作用。本发明提供的多重PCR检测方法可以弥补以上不足，提供一种链格孢菌快速高效的检测方法。多重PCR扩增结果表明:采用本发明特异引物检测的方法灵敏度高和特异性好，为红枣霉变的实时监测和快速诊断提供了有效手段，可以推广应用于果蔬加工、食品安全等领域。
【附图说明】
[0008]图1 为 Alt-Fl，Rl 引物特异性，M:DL 1000 DNA Marker ；1:XZJ1 ；2:XZJ2 ；3:扩展青霉；4:皮落青霉；5:根霉；6:毛霉；7:黑曲霉；8:链孢霉；9:长梗木霉；
[0009]图 2 为 Alt-F2，R2 引物特异性，M:DL 1000 DNA Marker ；1:XZJ1 ；2:XZJ2 ；3:扩展青霉；4:皮落青霉；5:根霉；6:毛霉；7:黑曲霉；8:链孢霉；9:长梗木霉。
【具体实施方式】
[0010]实施例1
[0011 ] 一种链格孢霉多重PCR快速检测方法，采用多重PCR技术一次性扩增沙门菌和大肠杆菌078的特异基因以及细菌16s rDNA的部分序列，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
[0012]本实施例所用主要试剂:
[0013]Tap酶、dNTP:均购自TaKaRa公司。真菌DNA提取试剂盒，Omega公司。
[0014]本实施例所用主要仪器:
[0015]5311 型 PCR 仪，德国 eppendorf 公司；
[0016]DYCP-31DN水平电泳仪(北京六一仪器厂)；
[0017]Tanon-2500R全自动数码凝胶图像分析系统(上海天能科技有限公司)。
[0018]上述链格孢霉多重PCR快速检测方法具体包括以下步骤:
[0019](I)合成引物
[0020]根据链格孢霉特异基因设计特异引物Alt-Fl/Alt-Rl，上述引物的核苷酸序列为:
[0021]Alt-Fl 5-TGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCT-3
[0022]Alt-Rl 5-CGACTTGTGCTGCGCTC-3
[0023](2)将霉变红枣上刮下的菌丝刮下、洗涤干燥，液氮研磨后转移至EP管中，使用试剂盒提取基因组DNA作为PCR反应的模板；
[0024](3)多重PCR扩增反应体系的建立
[0025]用Alt-Fl/Rl引物进行PCR，PCR反应体系为50yL:DNA模板2yL;10X缓冲液 5 μ L ；dNTP (每种 2.5mmol/L) 2 μ L ;弓I 物(10 μ M/L)各 2 μ L ；Taq DNA 聚合酶(5U/yL)0.4yL ;无菌水补足至50 μ L。PCR反应程序为:95 °C预变性5min，然后94°C变性30sec，52°C退火30sec，72°C延伸40sec，35个循环，72°C延伸lOmin。反应结束后取5 yLPCR产物加I yL 6X溴酚蓝上样缓冲液，在2%琼脂糖凝胶上IlOV电泳35min。根据条带有无和大小判定结果。
[0026]实施例2
[0027]本实施例所用主要试剂和仪器同实施例1。
[0028]上述链格孢霉多重PCR快速检测方法具体包括以下步骤:
[0029](I)合成引物
[0030]根据链格孢霉特异基因设计特异引物Alt-F2/Alt-R2，上述引物的核苷酸序列为:
[0031]Alt-F2 5-CTTTTGCGTACTTCTTGTTTCC-3
[0032]Alt-R2 5-CAGGCATGCCCTTTGGATAC-3，
[0033](2)将霉变红枣上刮下的菌丝刮下、洗涤干燥，液氮研磨后转移至EP管中，使用试剂盒提取基因组DNA作为PCR反应的模板；
[0034](3)多重PCR扩增反应体系的建立
[0035]用Alt-F2/R2引物进行PCR，PCR反应体系为50 μ L:DNA模板2 yL ;10X缓冲液 5 μ L ；dNTP (每种 2.5mmol/L) 2 μ L ;弓I 物(10 μ M/L)各 2 μ L ；Taq DNA 聚合酶(5U/yL)0.4yL ;无菌水补足至50 μ L。PCR反应程序为:95 °C预变性5min，然后94°C变性30sec，52°C退火30sec，72°C延伸40sec，35个循环，72°C延伸lOmin。反应结束后取5 yLPCR产物加I yL 6X溴酚蓝上样缓冲液，在2%琼脂糖凝胶上IlOV电泳35min。根据条带有无和大小判定结果。
[0036]实施例3
[0037]本实施例所用主要试剂和仪器同实施例1。
[0038]上述链格孢霉多重PCR快速检测方法具体包括以下步骤:
[0039](I)合成引物
[0040]根据例I和例2分别合成引物Alt-Fl/Alt-Rl和Alt_F2/Alt_R2，将2对引物按Alt-Fl/Alt-Rl:Alt-F2/Alt-R2 体积比比 3:1 的比例混合。
[0041](2)将霉变红枣上刮下的菌丝刮下、洗涤干燥，液氮研磨后转移至EP管中，使用试剂盒提取基因组DNA作为PCR反应的模板；
[0042](3)多重PCR扩增反应体系的建立
[0043]用混合引物进行PCR，PCR反应体系为50 μ L:DNA模板2 μ L ; 10 X缓冲液5 μ L ;dNTP (每种 2.5mmol/L) 2 μ L ;引物(10 μ M/L)各 2 μ L ；Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0.4 μ L ;无菌水补足至50 μ L。PCR反应程序为:95°C预变性5