促进干细胞分化为肝细胞的化合物的制作方法
【专利说明】促进干细胞分化为肝细胞的化合物
[0001] 本发明涉及使干细胞分化为更成熟化（adult-like)的肝细胞的化合物、其生产 方法以及含有它们的药用组合物。
[0002] 在药物研发过程中，十分需要体外培养方法（robust in vitro methods)用于肝 功能的建模。现有的采用人类原肝细胞培养物的方法具有众所周知的不足之处，即捐赠者 与捐赠者间的变化性和功能上的不稳定性。同样地，肝癌细胞系显示了机能上的不足，而且 也存在肿瘤细胞系中固有的混杂遗传异常。
[0003] 尽管多功能干细胞衍生的组织有希望解决捐赠者与捐赠者间变化性的问题，然而 迄今为止大多数检测人类诱导性多功能干细胞（hiPSC)衍生性肝细胞的报告都显示，这些 细胞相对于成人组织来说与胎儿组织更为相似，这可能会使得将其外推到成人体内的情况 更加困难。因此，需要更好的办法使干细胞分化为更成熟或成人化的肝细胞，以生成用于药 物发现、药物功效和安全测试的更相关的模型。
[0004] 使hiPSC成功分化为成人化的肝细胞将促进用于治疗慢性肝病的药物发现工作， 此类肝病例如肝炎B病毒（HBV)感染。慢性的HBV(CHB)感染在全世界影响了约3. 5亿人 口，存在巨大的未被满足的医疗需求。现有的疗法核苷抑制剂和干扰素（IFN)对清除病毒 不起作用，并且会产生病毒抗药性和/或不良副作用。基于此类病毒基因组序列的变化性， 将HBV分为7种基因型（基因型A - H ;A - D为主要基因型）。HBV感染疾病的结果取决于 年龄和基因型。因此，大多数CHB感染起因于垂直（母到婴）传递和/或童年感染。与之 不同的是，~90%接触病毒的成年人能够在6个月内清除HBV感染。此外，各种临床数据显 示病毒基因型影响HBV疾病的进程和对IFN疗法的应答。也同样已知，HBV能够通过各种机 制避开宿主免疫反应，此类机制包括下调干扰素刺激基因（ISGs)。对于HBV和宿主先天免 疫间复杂的相互作用的更好的理解可能导致产生治疗CHB感染的新的宿主/病毒靶点。然 而，探索新的、更加有效的HBV抗病毒药的工作被生理学健全的体外培养系统的缺乏所阻 碍。用作生产物（producer)和靶细胞的现有的基于肝癌的系统既不是健全的，也不能包括 HBV基因型的多样性。因此，极度需要新的体外系统，这种系统需要在生理学上更相关并且 支持（support)所有HBV主要基因型的强烈感染，优选得自临床隔离群。此类系统不仅可以 作为药物筛选平台，而且还可以作为HBV疾病模型，包括干扰素响应基因型依赖性的评价。
[0005] 因此，仍然需要提高干细胞-衍生的肝细胞分化为更成熟的肝细胞，以支持 (support)各种基因型导致的患者的HBV强烈感染（robust infection)，供作为药物筛选 平台和疾病模型使用。
[0006] 本发明涉及式I化合物及其可药用的盐和酯：
[0007]
[0008] 其中R1 _R11如下文所定义。此外，本发明涉及制造和使用式I化合物的方法以及 含有此类化合物的药用组合物。式I化合物用于使干细胞分化为更成熟或成年化的肝细胞 以用作药物筛选平台和在疾病模型平台中使用。
[0009] 图1提供了热图，显示在采用多剂量实施例1化合物处理后整体肝细胞功能的基 因表达增加。生物热图通常用在分子生物学中，以代表对比一些可比样本的许多基因的表 达水平（例如不同状态的细胞、不同患者的样本），这些样本获自cDNA样本。图1中，"绿 色"表示低表达，而"红色"表示高表达。图示的每行数据是相对的，生成从最低表达水平 (绿色）到中等水平（黑色）再到最高表达水平（红色）的梯度。
[0010] 图2显示，在采用实施例1 -7化合物处理后，基于一组成熟相关基因的基因表达， 在诱导性多功能干细胞衍生的肝细胞中，各种肝细胞功能的基因表达增加。
[0011] 图3A和3B显示iCell肝细胞中强烈的HBV感染。图3A为柱状图，显示以实施例 1化合物处理的诱导性多功能干细胞衍生的肝细胞引起细胞对HBV感染的敏感性，这种反 应以剂量依赖的方式出现。图3B为柱状图，显示病毒感染被干扰素抑制（100IU/ml)。
[0012] 图4A到4D显示iCell肝细胞中全-基因型的HBV感染，为一系列柱状图，显示 以实施例1化合物处理的诱导性多功能干细胞衍生的肝细胞能够支持全部四种HBV主要的 基因型（A-D)的强烈感染。维持强烈病毒感染需要实施例1化合物的持续使用。在HBV 感染（6d)前采用实施例1化合物预处理细胞6d，或在感染期间预处理6天。干扰素（IFN) 用于显示HBV感染的特异性。
[0013] 图5为柱状图，显示采用实施例1化合物处理的诱导性多功能干细胞衍生的肝细 胞支持从患者血清（临床隔离群）中分离出的HBV的感染，而不是细胞培养衍生的病毒 (HepG2. 2. 15)的感染。采用实施例1化合物处理的iCell肝细胞支持患者衍生的HBV感 染，而不是细胞培养衍生的HBV感染。
[0014] 图6A-I到6A-IV涉及HBV的感染性：血清与纯化的病毒，为一系列柱状图，显示 移除血清中存在的多余的HBsAg亚病毒颗粒（SVPs)是在采用实施例1化合物处理的诱导 性多功能干细胞衍生的肝细胞中获得强烈HBV感染的先决条件。细胞在HBV感染前（6d) 采用实施例1化合物预处理6d。
[0015] 图6BI和6B-II涉及由过量的HBsAg亚病毒颗粒（SVPs)中纯化HBV病毒颗粒， 显示纯化的病毒（戴恩颗粒）由HBsAgSVPs中通过Optiprep梯度超离心分离。采用病毒 标记（HBsAg和HBV DNA)和电子显微分析确认病毒的完全纯化。
[0016]图7a为采用实施例1化合物处理的诱导性多功能干细胞衍生的肝细胞的微阵列 分析（热图）。显示上调和下调>2倍（2hr)、>3倍（24hr)或>6倍（7天）处理后的基因。 早在2hr时实施例1化合物下调干扰素-刺激基因（ISGs)。显示在iCell肝细胞对HBV 感染易感性中也同样可能起作用的两个基因：显示CREB3L1 (早在处理后2hr时引起下调） 通过其它病毒（HCV、WNV和DNA病毒）抑制感染细胞的增生，据报道SLC10A1 (在处理7天 后引起上调）为JBV受体。
[0017]图7b涉及实施例1化合物对干扰素-刺激基因（ISGs)的作用，并提供饼图显示 实施例1化合物对诱导性多功能干细胞衍生的肝细胞中ISGs表达的动力学效应。975个干 扰素-刺激基因（ISGs)的列表以公共数据库中已知的ISGs(参见表1)为基础。
[0018] 图7c涉及实施例1化合物对ISG表达（975基因）的作用，并提供了饼图，显示采 用实施例1化合物处理24hr和7天时所调节的ISGs的例子。975个干扰素-刺激基因 (ISGs)的列表以公共数据库中已知的ISGs (参见表1)为基础。
[0019] 表1显示实施例1化合物对于ISGs在处理2hr、24hr和7天时的动力学效应（p 值〈〇? 05)。
[0020] 表 1
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[0023]
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[0026]
EGR1_[ .-48:8._|O'J棚_ HIF1A_ -4.78_丨ft.腦7_
1 PLSC'M,_ -2.59_(i 0087_
[0029]
[0030]
[0031]
[0032]
[0033]
[0034] 除另外说明外，在说明书和权利要求书中的以下具体术语和短语如下定义：
[0035] 术语"基团"指通过一或多个化学键与另一原子或分子连接从而形成分子中一部 分的一个原子或一组化学键合的原子。例如，式I中的变量R1-R11指与式I核心结构通过 共价键连接的基团。
[0036] 当述及具有一或多个氢原子的基团时，术语"取代的"指该基团中至少一个氢原子 被另一取代基或基团取代。
[0037] 术语"任选取代的"指（具有一或多个氢原子的）基团中一或多个氢原子可以但 不必须被另一个取代基取代。
[0038]术语"卤素"指氟、氯、溴或碘。
[0039] 除另外说明外，术语"氢"指氢原子（-H)而非H2。
[0040] 术语"在iCell肝细胞中"指由国际细胞动力学（CellularDynamics International(⑶I))获得的诱导性多功能干细胞衍生肝细胞。
[0041] 除另外说明外，术语"式化合物"指选自如该式所定义的化合物类的任一化合物 (包括任何此类化合物的任一可药用的盐或酯）。
[0042] 术语"可药用的盐"指保留游离碱或游离酸的生物有效性和性质的那些盐，这些盐 不是生物学或其它方面不可取的。此类盐可以由无机酸形成，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝 酸、磷酸等，优选盐酸；由有机酸形成，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二 酸、水杨酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、P_ 甲苯磺酸、N-乙酰基半胱氨酸等。此外，此类盐可以通过向游离酸中加入无机碱或有机碱 制备。无机碱衍生的此类盐包括但不限于钠、钾、锂、铵、钙和镁盐等。有机碱衍生的此类盐 包括但不限于：伯、仲和叔胺盐、（包括天然存在的取代的胺类）取代的胺类的盐、环胺类的 盐和碱性离子交换树脂的盐，例如异丙基胺、三甲基胺、二乙胺、三乙胺、三丙基胺、乙醇胺、 赖氨酸、精氨酸、N-乙基哌啶、哌啶、聚胺树脂等的盐。
[0043] 本发明化合物可以以可药用盐的形式存在。本发明化合物还可以可药用酯（即式 I酸的甲酯和乙酯）的形式存在。本发明化合物还可以溶剂化，即水化。溶剂化作用可在生 产过程中进行，也可以如由于初始无水式I化合物吸湿性质的结果（水合作用）发生。
[0044] 具有相同分子式，但其原子键合的性质或顺序不同或其原子的空间排列不同的化 合物称为"异构体"。原子空间排列不同的异构体称为"立体异构体"。非对映异构体为在一 或多个手性中心具有相反构型且不为对映异构体的立体异构体。具有一或多个互相不可重 叠镜像的不对称中心的立体异构体称为"对映异构体"。当化合物具有不对称中心（例如， 如果碳原子与四个不同的基团连接）时，可能为一对对映异构体。对映异构体可以以其不 对称中心的绝对构型表征，并由Cahn、Ingold和Prelog的R-和S-排序规则或者由分子 旋转偏振光平面的方式定义，指定为右旋或左旋（即分别为（+)或（_)-异构体）。手性 化合物可以单独对映异构体或其混合物形式存在。含有同等量的对映异构体的混合物被称 为"外消旋混合物"。
[0045] 术语化合物的"治疗有效量"指化合物的量，该量能有效预防、缓解或改善疾病症 状，或者延长接受治疗的对象的生存期。治疗有效量的测定在本领域内已知。本发明化 合物的治疗有效量或剂量可以在较宽的范围内变化，并且可以以本领域已知的方式决定。 此类剂量在每一具体情况中根据患者需求调整，所述具体情况包括服用的具体化合物、给 药方式、需要治疗的疾病，以及需要治疗的患者。一般而言，在口服或肠胃外给予体重大 约为70Kg的成年人药物时，适当的日剂量为约0?lmg-约5,OOOmg、lmg-约1，OOOmg或 lmg- 100mg，但是当需要时可以超过下限和上限。日剂量可以以单次量或分剂量给药，或者 肠胃外给药，也可以连续输注的形式给药。
[0046] 术语"可药用的载体"可包括任何与药物给药相容的材料，包括溶剂、分散介质、包 衣材料、抗细菌和抗真菌剂、等张的