快速方法生产高纯度癌干细胞和高纯度癌干细胞群的制作方法
【专利说明】快速方法生产高纯度癌干细胞和高纯度癌干细胞群
[0001] 优先权 本申请要求2012年10月25日提交的标题为"RapidProductionofHighPurity CancerStemCellsandPopulationofHighPurityCancerStemCells(高纯度癌干细 胞和高纯度癌干细胞群的快速生产）"的美国临时顺序号61/718, 643 (其由此以其整体结 合到本文中）和2012年8月15日提交的标题为"RapidMethodtoProduceHighPurity CancerStemCellsandPopulationofHighPurityCancerStemCells(生产高纯度 癌干细胞和高纯度癌干细胞群的快速方法）"的美国临时顺序号61/683, 477 (其也由此以 其整体结合到本文中）的优先权。
[0002] 本公开内容的领域 本公开内容涉及癌干细胞、用于细胞纯化的方法和试剂、用于刺激免疫应答的方法和 用于给予受试者的方法。组合物和相关方法可刺激针对肿瘤性病症特有的抗原或针对表达 所述抗原的细胞的免疫应答。本公开内容的肿瘤性病症包括黑素瘤、肝癌、胃癌和卵巢癌。
[0003] 背景 在实体瘤中，少部分细胞具有引发与亲代肿瘤相同的组织学异质性的肿瘤的能力。这 些细胞被称为"癌干细胞"。这些亦称为肿瘤引发细胞或癌引发细胞。癌干细胞可通过一 组性质定义。第一，它们具有使自身更新的能力。第二，在移植时它们能够建立新的肿瘤。 第三，它们可被描述为休眠的或慢循环的（细胞周期）肿瘤细胞。第四，它们可能是造成 肿瘤对化学疗法或放射疗法的抗性的原因。第五，它们依赖保持其更新和产生更分化的祖 细胞的能力的特殊微环境，其中所述环境保持癌干细胞的未分化状态。这种微环境可包括 间充质干细胞、组织相关成纤维细胞和内皮细胞。例如，在结肠癌干细胞的情况下，该微 环境包括肿瘤相关成肌纤维细胞的存在。（Schmidt等（2011)Oncotarget. 2:313-320; Borovski等（2011)CancerRes. 71 :634_639;Korkaya等（2011)J.Clin.Inv. 121: 3804-3809)。体外培养时形成球体（sphere)的能力是又一个特征，其可有助于鉴定特定细 胞为癌干细胞（Perego等（2011)J.Inv.Dermatol. 11: 546-547)。癌干细胞的一个非 限制性定义是能够复制亲代肿瘤的完全异质性，并且甚至在多次传代后仍继续生长的细胞 (Civenni等（2011)CancerRes. 71: 3098-3109)。
[0004] 已表明癌干细胞抑制免疫应答，其中抑制机制包括T调节细胞（Treg)的诱导、T细 胞活化和增殖的损害（Wei等（2010)Clin.CancerRes. 16:461-473)。
[0005] 癌干细胞通过其不断自我更新的能力建立和保持肿瘤块。另外，肿瘤干细胞还 在称为上皮-至-间充质变换状态中迀移。自我更新和迀移或侵袭特性的这些特征被认 为是癌症毒力的主要原因（Greaves等（2012)Clonalevolutionincancer(癌症的 克隆进化）.Nature. 481 (7381):第306-13页）。另外，癌干细胞具有免疫抑制性质 (Wu等（2010)Gliomacancerstemcellsinduceimmunosuppressivemacrophages/ microglia(神经胶质瘤癌干细胞诱导免疫抑制巨细胞/小胶质细胞）.Neuro.Oncol. 12:1113-1125)。因此，已研究通过例如消灭癌干细胞的试剂和方法，使癌干细胞作为抗癌 疗法的靶标。
[0006] 根据标志物和在小鼠中进行的连续移植异种移植物测定法，在多种实体瘤中鉴 定出推定的肿瘤干细胞。在黑素瘤中，几种表面标志物可鉴定肿瘤干细胞，但当在手术切 开术后测定时，这些标志物的表达在肿瘤之间是可变的。生物标志物⑶271是与神经嵴 源的细胞有关的生长因子受体。CD271可用于鉴定推定的黑素瘤干细胞，其中这些黑素瘤 干细胞可在系列稀释下在小鼠模型中增殖（Civenni等（2011)Human⑶271-positive melanomastemcellsassociatedwithmetastasisestablishtumorheterogeneity andlong-termgrowth(与转移有关的人⑶271-阳性黑素瘤干细胞建立肿瘤异质性和长 期生长）?CancerRes. 71: 3098-3109)。
[0007] 在胚胎发育期间神经嵴细胞的特性是其迀移的能力，一种间充质细胞的特性。保 持间充质特性的黑素瘤细胞是攻击性黑素瘤细胞类。CD146 (亦称为黑素瘤细胞粘附分 子（MCAM)和MUC18)是黑素瘤进展的标志物（Schlagbauer-Wadl等（1999)Influence ofMUC18/MCAM/CD146expressiononhumanmelanomagrowthandmetastasisin SCIDmice(SCID小鼠中MUC18/MCAM/⑶146表达对人黑素瘤生长和转移的影响）.IntJ Cancer. 81: 951-955)。CD146 (MCAM)也由正常的间充质干细胞表达（Rusell等（2010) StemCells. 28:788-798)。相同细胞上这两种标志物的共表达表明癌干细胞极具攻击性 的形式。
[0008] 使用非癌干细胞特异性培养基的传统方法一直是劳动密集型的和漫长的，其平均 生产时间为3. 8个月（范围为0. 6-22. 3个月，中位值3. 1)。这导致治疗时间延长，提交样 品的患者中仅29%接受治疗。通常，正常成纤维细胞的过度增殖需要熟练技术人员的大量 操作，这使得该方法昂贵。批量制备缺乏大量来自最有攻击性表型（即肿瘤引发细胞或癌 干细胞）的抗原。
[0009] 通过分离并使患者肿瘤样品中的推定的癌干细胞增殖到用于加载树突细胞所需 要的量，本公开内容提供超出传统方法的益处。
[0010] 本公开内容的概述 本公开内容提供可用于给予患有肿瘤性病症的受试者的试剂（包括细胞）和相关方 法。所述试剂和方法包括纯度提高的癌干细胞。肿瘤性病症包括黑素瘤、卵巢癌、结肠直肠 癌、乳腺癌和肺癌。
[0011] 本公开内容提供来源于人黑素瘤肿瘤的分离的细胞群，其中：（i)所述群中至少 30%的细胞表达⑶146,且所述群中至少30%的细胞表达⑶271，或（ii)其中至少30%的细 胞共表达⑶146和⑶271，其中百分比值（%)定义为相对于所述群的平均值。此外，提供上 述分离的细胞群，其中：表达为至少35%;且共表达为至少35%。此外，提供上述细胞群，其 中：表达为至少40% ;且共表达为至少40%。此外，提供上述细胞群，其中：表达为至少45% ; 且共表达为至少45%。另一方面，提供上述细胞群，其中：表达为至少50% ;且共表达为至少 50% 〇
[0012] 还考虑上述分离的细胞群，其中低于5%的细胞是污染的细胞，或其中低于2%的细 胞是污染的细胞。
[0013] 在疫苗实施方案中，提供包含自体树突细胞的疫苗，其中树突细胞加载了上述分 离的细胞群，且其中树突细胞和人肿瘤来自同一人类受试者。
[0014] 提供上述疫苗，其中在加载到树突细胞上之前，所述细胞群包含防止细胞分裂的 辐射损伤，或包含防止细胞分裂的核酸交联剂。
[0015] 在另一个疫苗实施方案中，提供包含自体树突细胞的疫苗，其中树突细胞加载了 来源于人黑素瘤肿瘤的分离的细胞群的至少一种，其中：（i)该群中至少50%的细胞表达 ⑶146,且该群中至少50%的细胞表达⑶271，或（ii)其中至少50%的细胞共表达⑶146和 CD271，其中百分比值（%)定义为相对于所述群的平均值，且其中树突细胞和人肿瘤来自同 一人类受试者。
[0016] 提供上述疫苗，其中在加载到树突细胞上之前，所述细胞群包含防止细胞分裂的 辐射损伤，或包含防止细胞分裂的核酸交联剂。
[0017] 提供来源于人黑素瘤肿瘤的分离的细胞群，其中所述群中至少30%的细胞表达 ⑶146,且至少30%的细胞表达⑶271，或其中至少30%的细胞共表达⑶146和⑶271，其中所 述细胞通过包括以下步骤的方法制备：步骤i.将黑素瘤肿瘤样品中的细胞分散，步骤ii. 在低粘附表面或超低粘附表面上培养，步骤iii.沉降以收集微球体；和步骤iv.将细胞 从微球体中分离。
[0018] 进一步提供上述方法，所述方法还包括为扩增细胞，在培养基中在粘附表面上培 养以产生扩增细胞群的步骤（步骤v.)。
[0019] 提供上述方法，其中步骤（ii)包括在低粘附表面上培养，或其中步骤（ii)不包括 在低粘附表面上培养，或其中步骤（ii)包括在超低粘附表面上培养，或其中步骤（ii)包括 在超低粘附表面上和不在低粘附表面上培养。
[0020] 提供来源于人黑素瘤肿瘤的分离的细胞群，其中所述群中至少30%的细胞表达 ⑶146,且至少30%的细胞表达⑶271，或其中至少30%的细胞共表达⑶146和⑶271，其中所 述细胞通过包括以下步骤的方法制备：步骤i.将黑素瘤肿瘤样品中的细胞分散，步骤ii. 在低粘附表面或超低粘附表面上培养，步骤iii.沉降以收集微球体；和步骤iv.将细胞 从微球体中分离。
[0021] 提供上述细胞群，其中与在步骤i的细胞中是可检出的表达相比，分离的细胞群 具有以下的至少一种：（i)减量调节的免疫抑制分子；（ii)增量调节的MHC-II;或（iii)减 量调节的免疫抑制分子和增量调节的MHC-II。
[0022] 提供上述细胞，其中免疫抑制分子是吲哚胺-吡咯-2, 3-双加氧酶、肿瘤生长因 子和白介素-10 (IL-10)的至少一种，且其中与在步骤i中是可检出的表达（定义为 100%)相比，减量调节是至80%或更低的水平。
[0023] 提供上述细胞，其中将细胞从黑素瘤肿瘤样品和微球体的一种或两种中分散包括 用添加的蛋白酶处理。
[0024] 提供上述细胞，其中在低粘附表面上的培养是在碱性成纤维细胞生长因子（bFGF) 存在下。
[0025] 提供上述细胞，其中在低粘附表面或超低粘附表面上的培养包括收集已经形成的 任何肿瘤干细胞球体，其中所述收集每隔2-3天进行，将所收集的球体在新鲜培养基中在 低粘附表面上恢复培养。
[0026] 在疫苗实施方案中，提供包含加载了上文公开的分离细胞群的自体树突细胞的疫 苗，其中树突细胞和人肿瘤来自同一人类受试者。
[0027] 在其它疫苗实施方案中，提供上述疫苗，其中在加载到树突细胞中之前，通过照射 肿瘤细胞或通过将核酸交联剂加入肿瘤细胞中，来防止肿瘤细胞分裂。
[0028] 提供来源于人黑素瘤肿瘤的分离的细胞群，其中所述群中至少30%的细胞表达 ⑶146,且至少30%的细胞表达⑶271，或其中至少30%的细胞共表达⑶146和⑶271，其中所 述细胞通过包括以下步骤的方法制备：步骤i.将黑素瘤肿瘤样品中的细胞分散，步骤ii. 在低粘附表面或超低粘附表面上培养，步骤iii.沉降以收集微球体，步骤iv.将细胞从 微球体中分离，和步骤v为了扩增细胞在培养基中在粘附表面上培养以产生扩增细胞群。
[0029] 提供上述方法，其中步骤（ii)包括在低粘附表面上培养，或其中步骤（ii)不包括 在低粘附表面上培养，或其中步骤（ii)包括在超低粘附表面上培养，或其中步骤（ii)包括 在超低粘附表面上和不在低粘附表面上培养。
[0030] 提供上述细胞，其中与在步骤i的细胞中是可检出的表达相比，分离的细胞群具 有以下的至少一种：（i)减量调节的免疫抑制分子；（ii)增量调节的MHC-II;或（iii)减量 调节的免疫抑制分子和增量调节的MHC-II。
[0031] 提供上述细胞，其中免疫抑制分子是吲哚胺-吡咯-2, 3-双加氧酶、肿瘤生长因 子和白介素-10 (IL-10)的至少一种，且其中与在步骤i中是可检出的表达（定义为 100%)相比，减量调节是至80%或更低的水平。
[0032] 提供上述细胞，其中将细胞从黑素瘤肿瘤样品和微球体的一种或两种中分散包括 用添加的蛋白酶处理。
[0033] 提供上述细胞，其中在低粘附表面上的培养是在碱性成纤维细胞生长因子（bFGF) 存在下。
[0034] 提供上述细胞，其中为了扩增细胞在粘附表面上的培养是在含有bFGF的培养基 中。
[0035] 提供上述细胞，其中在低粘附表面上的培养包括收集已经形成的任何肿瘤干细胞 球体，其中所述收集每隔2-3天进行，将所收集的球体在新鲜培养基中在低粘附表面上恢 复培养。
[0036] 提供上述细胞，其中在粘附表面上培养的总时间选自是12-30天、14-28天或 18-24天的期限。
[0037] 在疫苗实施方案中，提供包含加载了上文公开的分离细胞群的自体树突细胞的疫 苗，其中树突细胞和人肿瘤来自同一人类受试者。
[0038] 在其它疫苗实施方案中，提供上述疫苗，其中在加载到树突细胞上之前，通过照射 肿瘤细胞或通过将核酸交联剂加入肿瘤细胞中，来防止肿瘤细胞分裂。
[0039] 在方法实施方案中，提供用于刺激针对一种或多种黑素瘤特异性抗原的抗原特异 性免疫应答的方法，所述方法包括给予包含活的黑素瘤细胞的人类受试者包含加载了上述 分离的细胞群的自体树突细胞的疫苗，其中树突细胞和人肿瘤来自同一人类受试者。还提 供上述方法，其中黑素瘤特异性抗原是MAGE抗原。
[0040] 在另一个方法实施方案中，提供用于产生纯化的癌干细胞的方法，所述方法包括 以下步骤：(a)将之前通过分离肿瘤样品的细胞而获得的细胞悬液浸入神经元干细胞培养 基中，并且在超低粘附容器或低粘附容器中培养；(b)允许癌干细胞球体形成；（c)通过沉 降回收癌干细胞球体以产生回收的球体；（d)将回收的球体重新培养；(e)在所述重新培养 期间允许回收的球体彼此缔合；（f)使缔合的球体分离以产生单细胞悬液。
[0041] 提供上述方法，其中步骤（a)包括在低粘附容器中培养，或其中步骤（a)不包括在 低粘附容器中培养，或其中步骤（a)包括在超低粘附容器中培养，或其中步骤（a)包括在超 低粘附容器中和不在低粘附容器中培养。
[0042] 此外，提供上述方法，所述方法还包括在分离肿瘤样品以产生细胞悬液的步骤之 前获得肿瘤样品的步骤。此外，提供上述方法，所述方法还包括建立增殖性贴壁细胞培养物 并扩增细胞的步骤。
[0043] 本发明提供来源于人黑素瘤肿瘤的分离的细胞群，其中所述群中至少30%的细胞 表达⑶146,且其中所述群中至少30%的细胞表达⑶146,或其中至少30%的细胞共表达 CD146和CD271，其中百分比值是相对于该群的平均值。
[0044] 还提供上述细胞群，其中该群中至少40%的细胞表达⑶146,且至少40%的细胞表 达⑶271，或其中至少40%的细胞共表达⑶146和⑶271，其中百分比值定义为相对于该群 的平均值。
[0045] 还提供上述细胞群，其中该群中至少50%的细胞表达⑶146,且至少50%的细胞表 达⑶271，或其中至少50%的细胞共表达⑶146和⑶271，其中百分比值是相对于该群的平 均值。
[0046] 还提供上述细胞，其中在粘附表面上培养导致所述扩增细胞群中免疫抑制分子减 量调节。还提供上述细胞，其中在粘附表面上培养导致免疫抑制分子减量调节，且（i)其中 免疫抑制分子是吲哚胺-吡咯2, 3-双加氧酶、肿瘤生长因子和白介素-10 (IL-10)的 至少一种，且（ii)其中在粘附表面上培养之前至少一种免疫抑制分子的表达为100%，且其 中在粘附表面上培养之后的减量调节导致处于是以下水平的表达：低于80%、低于70%、低 于60%、低于50%、低于40%、低于30%、低于20%、低于10%、或低于约80%、低于约70%、低于约 60%、低于约50%、低于约40%、低于约30%、低于约20%、低于约10%等。
[0047]bFGF，或另一种生长因子，或与一种或多种生长因子组合的bFGF，可各自以下列浓 度使用：约 〇? 5ng/mL、约 1. 0ng/mL、约 2. 0ng/mL、约 5. 0ng/mL、约 10ng/mL、约 12ng/ mL、约 15ng/mL、约 20ng/mL、约 25ng/mL、约 30ng/mL、约 40ng/mL、约 50ng/mL，或以下 列范围使用：〇? 5-1. 0ng/mL、1-2ng/mL、2_4ng/mL、1-5ng/mL、5-10ng/mL、10-12ng/mL、 10-15ng/mL、15_20ng/mL、20_25ng/mL、25_30ng/mL、20_30ng/mL、30_40ng/mL等。还 提供排斥性实施方案。例如，本公开内容可不包括这样的方法，且可不包括这样的培养基， 其中bFGF以 0? 5ng/mL、L0ng/mL、2. 0ng/mL、5. 0ng/mL、10ng/mL、12ng/mL、15ng/mL、 20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL存在，或以0? 5_L0ng/mL、1-2ng/mL、 2-4ng/mL、1-5ng/mL、5-10ng/mL、10-12ng/mL、10-15ng/mL、15-20ng/mL、20-25ng/ mL、25_30ng/mL、20_30ng/mL、30_40ng/mL等范围存在。上述备选实施方案，以及上述排 斥性实施方案可适用于与非粘附表面（或极低粘附表面，或超低粘附表面）一起使用的培 养基。此外，上述备选实施方案，以及上述排斥性实施方案可适用于与粘附表面一起使用的 培养基。
[0048] 此外，提供上述细胞，其中用于培养细胞的培养基无一包含动物产品。还提供上 述细胞，其中从黑素瘤肿瘤样品和微球体的一种或两种中分散细胞包括用添加的蛋白酶处 理。还提供上述细胞，其中从黑素瘤肿瘤样品中分散细胞包括添加的胶原酶。还提供上述 细胞，其中从微球体中分散细胞包括用添加的胰蛋白酶处理。
[0049] 本公开内容提供分离的细胞群，其中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少 60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的细胞表达CD146,或其中至少20%、至少30