信使rna加帽效率的定量评估的制作方法

文档序号:9332233阅读:1058来源:国知局
信使rna加帽效率的定量评估的制作方法
【专利说明】信使RNA加帽效率的定量评估
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年3月14日提交的美国临时专利申请序号61/784, 337的优先 权,其公开内容通过引用整体并入本文。
[0003] 背景
[0004] 信使RNA("mRNA")疗法正成为用于治疗多种疾病的日益重要的方法。有效的mRNA 疗法需要将mRNA有效递送至患者以及在患者体内有效生成由该mRNA编码的蛋白。为了优 化mRNA递送和体内蛋白生成,通常在构建体的5'端需要适当的帽,其防止mRNA降解并促 进成功的蛋白翻译。因此,加帽效率的准确表征对于确定mRNA治疗应用的质量是特别重要 的。
[0005] 发明概述
[0006] 本发明提供了用于准确且定量测定mRNA加帽效率的改良方法,特别是体外合成 的mRNA。如上讨论的,适当的加帽对于成功的体内蛋白生成是重要的。然而,在本发明之 前,大多数帽测定是定性的,这不足以评估基于mRNA的治疗产品质量和相关的体内使用安 全性和效力。事实上,在本发明之前,还没有可用的允许在不永久改变样品中mRNA的条件 下定量加帽效率的方法。
[0007] 如下详细描述的,本发明部分基于通过色谱产生和定量加帽片段和未加帽片段。 因此,本发明提供了用于评估mRNA加帽效率的简单、可靠且有效的定量方法。本发明特别 用于mRNA生产期间的质量控制以及mRNA作为最终治疗产品中活性药物成分(API)的表 征。
[0008] -方面,本发明提供了定量mRNA加帽效率的方法,包括以下步骤:⑴提供包含加 帽mRNA和未加帽mRNA的mRNA样品;(2)在允许与邻近加帽或未加帽的mRNA的倒数第二 个碱基的所述mRNA的5'未翻译区中的序列互补的DNA寡核苷酸与所述序列复性的条件下 使所述mRNA样品与所述DNA寡核苷酸接触;(3)提供选择性降解DNA/RNA杂合体和/或未 复性mRNA的一种或多种核酸酶,得到加帽片段和未加帽片段;(4)通过色谱分离所述加帽 片段和未加帽片段;和(5)测定所述加帽片段和未加帽片段的相对量,从而定量mRNA加帽 效率。
[0009] 在一些实施方案中,本发明的发明方法可用于定量具有式I结构的帽:
[0010]
[0011]其中,
[0012] B是核喊基;
[0013] 札选自卤素、0H和0CH3;
[0014] R2选自H、0H和 0CH3;
[0015] R3是CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3或不存在;
[0016] &是順2;
[0017] R5选自OH、OCH3和卤素;
[0018] n是1、2或3;并且
[0019] M是该mRNA的核苷酸。
[0020] 在一些实施方案中,该核碱基是鸟嘌呤。
[0021] 在一些实施方案中,本发明的发明方法可用于定量具有式II结构的m7G帽或具有 式III结构的未甲基化帽:
[0022]
[0023] 其中,
[0024] 私是11或013;
[0025] 心是順2;
[0026] R5是 0H或 0CH3;
[0027] &是11或013;并且
[0028] M是该mRNA的核苷酸。
[0029]
[0030] 其中M是所述mRNA的核苷酸。
[0031] 在一些实施方案中,步骤(4)进一步分离甲基化加帽RNA和未甲基化加帽RNA。在 一些实施方案中,甲基化的帽包括在如式I所示私和/或R5位置的甲基化。在一些实施方 案中,根据本发明的发明方法还包括定量测定所述加帽RNA的甲基化百分比的步骤。
[0032] 在一些实施方案中,适合的DNA寡核苷酸长度大约10-80个核苷酸(例如,长度 约 10-75、10-70、10-65、10-60、10-55、10-50、10-45、10-40、10-35、10-30、10-25、10-20、或 10-15个核苷酸)。在一些实施方案中,适合的DNA寡核苷酸长度是或大于约10、15、20、25、 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80个核苷酸。在一些实施方案中,适合的DNA寡核苷 酸的一侧或两侧具有一个或多个RNA核苷酸(例如,1、2、3、4、5或更多个RNA核苷酸)。
[0033] 在一些实施方案中,适合的DNA寡核苷酸与在从加帽或未加帽的mRNA倒数第二个 碱基的1、2、3、4或5个碱基内的所述mRNA的5'未翻译区中的序列互补。
[0034] 在一些实施方案中,选择性降解DNA/RNA杂合体和/或未复性RNA的一种或多种 核酸酶包括RNA酶H。在一些实施方案中,选择性降解DNA/RNA杂合体和/或未复性RNA的 一种或多种核酸酶包括产生平端加帽片段和未加帽片段的核酸酶。在一些实施方案中,所 述一种或多种核酸酶包括核酸酶S1和/或RNA酶H、或另一种5'核酸外切酶。
[0035] 在一些实施方案中,来自步骤(3)的加帽片段和未加帽片段包括所述mRNA的不超 过5个碱基(例如,不超过4、3、2或1个)。在一些实施方案中,来自步骤(3)的加帽片段 和未加帽片段包括所述mRNA的不超过2个碱基。
[0036] 在一些实施方案中,本文描述的发明方法的步骤(4)包括将所述加帽片段和未加 帽片段施加至色谱柱的步骤。在一些实施方案中,适合的色谱柱选自由以下组成的组:阴离 子交换HPLC柱、阳离子交换HPLC柱、反相HPLC柱、疏水相互作用柱、高效液相色谱柱或尺 寸排阻柱。
[0037] 在一些实施方案中,本文描述的发明方法的步骤(5)包括测定所述加帽片段和未 加帽片段的相对峰面积。
[0038] 在一些实施方案中,根据本发明的发明方法用于定量体外合成的mRNA样品的 mRNA加帽效率。
[0039] 本发明还尤其提供了用于进行本文描述的发明方法的组合物和试剂盒。在一些实 施方案中,本发明提供了定量mRNA加帽效率的试剂盒,包括以下一种或多种:(1)与邻近加 帽或未加帽的mRNA的倒数第二个碱基的待定量的mRNA的5'未翻译区中的序列互补的DNA 寡核苷酸;(2)用于DNA与RNA之间复性的一种或多种试剂;(3)选择性降解DNA/RNA杂合 体和/或未复性mRNA的一种或多种核酸酶(例如,RNA酶H和/或核酸酶S1);和(4)用于 进行色谱(例如色谱柱)的一种或多种试剂。
[0040] 而在另一方面,本发明提供了生产mRNA的方法,包括根据本文描述的方法定量 mRNA加帽效率的步骤。在一些实施方案中,根据本发明的生产方法包括基于定量mRNA加 帽效率结果来调整生产条件的步骤。在一些实施方案中,定量步骤在释放mRNA批次之前进 行。
[0041] 本发明还尤其提供了根据本文描述的方法生产的mRNA。
[0042] 如本申请中使用的,术语"约"和"大约"作为等同物使用。本申请中有或没有约/ 大约而使用的任何数值意思涵盖相关领域普通技术人员理解的任何正常波动。
[0043] 本发明的其他特征、目的和优点在随后详述中是明显的。但应理解,详述表明本发 明的实施方案,仅作为示例而非限制给出。对于本领域技术人员而言,本发明范围内的各种 变化和调整将根据详述而变得显而易见。
[0044] 附图简述
[0045] 附图为了示例说明目的而绝非限制。
[0046] 图1描绘了在色谱分离之前包括mRNA的酶操作的示例性实施方案。使用DNA寡 核苷酸引物复性邻近可能存在的帽〇或帽1结构的mRNA。提供核酸酶以消化DNA:RNA杂合 体中的RNA,从而产生加帽或未加帽的分析物。
[0047] 图2是本发明各个实施方案中存在的示例性mRNA加帽结构和未加帽结构的图。
[0048] 图3是说明如通过ELISA测量的、分泌的人类a-半乳糖苷酶(GLA)蛋白水平的 定量的条线图。检测到的蛋白是其从经由单剂量脂质纳米颗粒(30ug包封的GLAmRNA)静 脉内递送的GLAmRNA在施用后6小时生成的结果。
[0049] 定义
[0050] 为了更容易理解本发明,首先定义某些术语。说明书通篇给出了以下术语和其他 术语的额外定义。
[0051] 亲和力:如本领域已知的,"亲和力"是特定配体结合(例如,非共价结合)紧密度 的量度和/或特定配体与其配偶体解离的速率或频率。如本领域已知的,许多技术的任何 一个可用于测定亲和力。在许多实施方案中,亲和力代表特异性结合的量度。
[0052] 退火或杂交:如本文使用的,术语"退火"、"杂交"和语法等同物指足够互补以经由 瓦特生-克里克(Watson-Crick)碱基配对或非正则碱基配对形成复合物的核苷酸序列之 间形成复合物(还称为双链体或杂交体)。还要理解,退火或杂交序列不需要具有提供给稳 定杂交体的完美互补性。在许多情况下,稳定杂交体会在少于约10%碱基错配时形成。因 此,如本文使用的,术语"互补的"指在特定条件下与其互补体形成稳定双链体的核酸分子, 一般情况是存在约90%或更大同源性(例如,约95%或更大、约98%或更大、或约99%或 更大同源性)。本领域技术人员理解如何估计和调节杂交条件的严格性,使得至少具有所需 水平互补性的序列会稳定杂交,而具有较低互补性的那些则不会。有关杂交条件和参数的 实例,参见例如Sambrook等人,"MolecularCloning:ALaboratoryManual",1989,第 二版,ColdSpringHarborPress:Plainview,NYandAusubel,"CurrentProtocolsin MolecularBiology",1994,JohnWiley&Sons:Secaucus,NJ。如果所有核酸喊基匹配,则 两个核酸分子之间的互补性称为"完全"、"全部"或"完美",否则称为"部分"。
[0053] 大约:如本文使用的,应用至一个或多个关注值的术语"大约"或"约"指与参考值 类似的值。在某些实施方案中,除非另外说明或者根据上下文明显的,术语"大约"或"约" 指在任一方向(大于或小于)落入该参考值25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、 13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小的值范围(除了此 类数字会超出可能值的100%的情况)。
[0054] 色谱:如本文使用的,术语"色谱"指分离混合物的技术。通常,将混合物溶解于称 为"流动相"的流体中,流动相携带混合物通过容纳称为"固定相"的另一种物质的结构。柱 色谱是其中固定床在管(即,柱)内的分离技术。
[0055] 化合物和剂:术语"化合物"和"剂"在本文可互换使用。它们指任何天然存在或 非天然存在的(即,合成的或重组的)分子,例如生物大分子(例如,核酸、多肽或蛋白),有 机或无机分子,或从生物材料例如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物,包括人)细胞 或组织制成的提取物。化合物可以是单一分子或者至少两个分子的混合物或复合物。
[0056] 对照:如本文使用的,术语"对照"具有其本领域理解的含义,作为结果对比的标 准。通常,对照通过分离变量以得出有关此类变量的结论而用于增加实验完整性。在一些 实施方案中,对照是与测试反应或测定同时进行以提供对比者的反应或测定。在一个实验 中,应用"测试"(即,变量被测试)。在第二个实验"对照"中,不应用测试的变量。在一些 实施方案中,对照是历史对照(即,之前进行的测试或测定,或者之前已知的量或结果)。在 一些实施方案中,对照是或包括印刷或以其他方式保留的记录。对照可以是阳性对照或阴 性对照。
[0057] 试剂盒:如本文使用的,术语"试剂盒"指用于递送材料的任何递送系统。此类递 送系统可以包括允许储存、运输或递送各种诊断或治疗试剂(例如,在适当容器中的寡核 苷酸、抗体、酶等)和/或支持材料(例如,缓冲剂,用于进行测定的书写说明书,等)从一 个地方至另一个地方的系统。例如,试剂盒包括含有相关反应试剂和/或支持材料的一个 或多个外壳(例如,盒子)。如本文使用的,术语"片段化试剂盒"指包括两个或多个单独容 器的递送系统,该容器各自包含总体试剂盒组分的子部分。容器可以一起或单独递送至预 期接受者。例如,第一容器可以包含用于测定的酶,而第二容器包含寡核苷酸。术语"片段 化试剂盒"预期涵盖包含美国联邦食品、药品和化妆品法案的第520(e)章下管理的分析物 特异性试剂(ASR)的试剂盒,但不限于此。实际上,术语"片段化试剂盒"包括包含各自包含 总体试剂盒组分的子部分的两个或多个单独容器的任何递送系统。相反,"组合试剂盒"指 在单一容器(例如,在容纳所需组分每一个的单一盒子)中包含所有组分的递送系统。术 语"试剂盒"包括片段化试剂盒和组合试剂盒。
[0058] 核苷:如本文使用的,术语"核苷"或"核碱基"指与糖类例如D-核糖(RNA中) 或2' -脱氧-D-核糖(DNA中)通过糖类的异头碳(糖类的1' -碳原子)与核碱基之间的N-糖苷键连接的腺嘌呤("A")、鸟嘌呤("G")、胞嘧啶("C")、尿嘧啶("U")、胸腺嘧啶 ("T")及其类似物。当核碱基是嘌呤例如A或G时,核糖一般连接至嘌呤杂环的N9-位。当 核碱基是嘧啶例如C、T或U时,糖一般连接至杂环的N1-位。糖类可以是取代或未取代的。 取代的核糖包括但不限于其中碳原子的一个或多个(例如2'-碳原子)经相同或不同C1、 F、一R、一0R、一冊2或卤素基团的一个或多个取代的那些,其中每个R独立为H、C 烷基 或(:5-(:14芳基。核糖实例包括核糖、2' -脱氧核糖、2',3' -二脱氧核糖、2' -卤代核糖、2' -氟 代核糖、2' -氯代核糖和2' -烷基核糖,例如2' -0-甲基、4' -a-异头核苷酸、1' -a-异头核 苷酸(Asseline等人,NUCL.ACIDSRES.,19 :4067-74[1991])、2' -4' -和 3' -4' -连接的和 其他"锁定的"或 "LNA" 双环糖修饰(W0 98/22489 ;W0 98/39352 ;W0 99/14226)。
[0059] 核苷酸:如本文使用的术语"核苷酸"表示磷酸化形式的核苷(核苷的磷酸酯),作 为单体单元或者多核苷酸多聚物内。"核苷酸5' -三磷酸"指在5'位置具有三磷酸基团的核 苷酸,有时表示为"NTP"或"dNTP"和"ddNTP",以特别指出核糖的结构特征。三磷酸基团可 以包括各种氧部分的硫取代,例如a-硫代-核苷酸5'-三磷酸。核苷酸可以单_、二-或 三-磷酸化形式存在。核苷酸中存在的核糖的碳原子用上撇号(')指定,以使其区别于碱 基中的骨架编号。关于多核苷酸和核酸化学的综述,参见Shabarova,Z.和Bogdanov,A. AdvancedOrganicChemistry
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