一种磷光铱配合物的合成及其用于血吸虫尾蚴荧光标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于寄生虫病防治的生物光学标记领域，更具体地，本发明涉及一类磷光 铱配合物的合成及其用于血吸虫尾蝴荧光标记，本发明提供了一种新颖的血吸虫尾蝴荧光 标记方法，该类磷光铱配合物具有血吸虫尾蝴荧光标记的有益效果。
【背景技术】
[0002] 全球人类寄生虫病中，血吸虫病是仅次于疟疾的第二大热带寄生虫病。血吸虫病 流行于74个国家和地区，估计目前有6. 52亿人口受威胁，有1. 93亿感染者，有症状病例约 1. 2亿，其中2000万为严重病例。我国是血吸虫病的主要流行区，血吸虫病是一种典型的经 水源传播的人兽共患寄生虫病，血吸虫尾蝴对宿主感染力非常强，成虫繁殖速度快，数量惊 人。近年来频繁发生的洪涝灾害，更加快了血吸虫病的扩散、蔓延。血吸虫尾蝴是感染人畜 的唯一阶段，所以控制尾蝴是治理血吸虫病的关键环节。目前，部分抗血吸虫药物对血吸虫 尾蝴有良好的杀灭效果，但其确切的作用机理尚不完全清楚。研究者通过使用传统的研究 方法来探索这些药物的可能作用机理，但是，这些传统研究手段都是一个离体(死亡）的检 测，不能直接反映药物在活体上的作用方式和位点，中间环节会影响结果的准确性和可信 度。所以，需要寻找新的研究方法来弥补目前存在的不足。
[0003] 荧光成像是一项灵敏的、非侵入式、费用低廉的可视化检测途径，其分辨率可达百 纳米，可实现从细胞到动物的活体成像，荧光成像手段具有监测灵敏、成像迅速、可同时观 测多分子事件等优点。基于有机荧光染料的荧光成像广泛用于寄生虫方面的研究，如曼氏 血吸虫研究中Andrea B. Kohn等人米用4, 5-diaminoXuorescein_2焚光探针检测血吸虫 体内一氧化氮的含量。但是，使用有机小分子荧光染料作为荧光探针，存在以下的缺点： (1)有机荧光染料激发与发射位于紫外或者可见光区域，在荧光成像时容易产生组织光损 伤和生物组织自发荧光问题，干扰荧光成像的质量；（2)有机荧光染料的抗光漂白性较差， 受强激发光照射与照射时间增加时，容易产生光漂白现象，其荧光强度显著下降，导致荧光 成像时信号太弱无法检出。
[0004] 相比于其它发光材料而言，磷光金属配合物与传统的几类荧光染料相比具有优异 的磷光物理性质，如具有Stokes位移大、发光效率高、光稳定性好、发光颜色可调、发光寿 命长等优点。磷光配合物具有较长的发光寿命，通过时间分辨技术可以减少或消除样品自 发荧光的影响。
[0005] 但是，目前磷光铱配合物用于血吸虫尾蝴的荧光标记尚无系统的研究，如何实现 磷光配合物对尾蝴的荧光标记是难点，其主要原因是血吸虫尾蝴是完整的生物体，具有完 整的生命新陈代谢系统。比如，尾蝴表皮上的糖萼具有抗原性质，也具有使尾蝴机体得到保 护免受外界影响的作用。如何实现荧光染料对尾蝴的有效荧光标记，需要系统研究尾蝴荧 光标记与磷光配合物结构方面的构效关系，同时磷光配合物需要满足发光效率高、光稳定 性好和生物相容性好的特性，这样的标记方法不同于传统的细胞荧光标记，尾蝴的磷光配 合物标记具有更多的影响因素和技术上的困难。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一类磷光铱配合物，该类配合物的磷光发射可以通过改变环金属配 体的结构实现发射波长从可见光到近红外光的调节，并具有较高的发光量子效率和较长的 发射寿命，具有对日本血吸虫尾蝴进行磷光标记的性能，可作为日本血吸虫尾蝴磷光标记 试剂。
[0007] 本发明的铱配合物的结构是通过两个含氮芳香化合物为双齿配体、辅以一个含双 氮芳香化合物，配位形成铱配合物。该类铱配合物具有下式结构：
式中含氮的芳香化合物的双齿配体和辅助双齿配体，其去质子后能与铱原子配位形成 六元配位的发光铱配合物。
[0008] 其中丨
基团为含氮芳香基团及其衍生物，优选为下述基团之一：
2.通式中辅助配体
中X可以为氮，优选为下述配体之一：
3.通式中抗衡阴离子Y为下述离子：PF6、Cl。
[0009] 本发明化合物可按照如下合成路线制备：
合成路线中第一步可按本领域已知的方法制备(参见Nonoyama, K.及/以.CAeva //w. 1974，47，467-468.)。制备本发明化合物的原料和所用试剂均为已知化合物，可以 在市场上获得，或可用本领域已知的方法制备。
[0010] 将三氯化铱水合物与含氮的双齿配体：在2-乙氧基乙醇和水的混合溶液中加 热反应24-48小时，得到铱二氯桥配合物；然后，得到的产物在有机溶剂、水或者混合溶剂 中与相应的辅助配体
反应4-24小时，合成到所需的目标产物。
[0011] 上述任意一种磷光铱配合物作为血吸虫尾蝴荧光标记染料。
[0012] 尾蝴荧光标记方法包括如下步骤： 新鲜的尾蝴从感染毛蝴的阳性的钉螺得到，取阳性螺于100 mL锥形瓶中，加入清水至 瓶口，在白炽灯下光照2小时左右逸出尾蝴； 磷光配合物用二甲基亚砜溶解准确配制成I mmol的母液，然后再用PBS缓冲液稀释 成5 μΜ的稀释液；移取200 yL的稀释液加入到荧光成像器皿中，用自制的铁丝圈取新 鲜尾蝴加入到稀释液中，在室温下荧光染色5分钟至6小时，激光共聚焦荧光显微镜观察尾 蝴的磷光标记情况，并采集磷光信号进行荧光成像。
[0013] 发明人通过系统的设计与合成，将发光铱配合物作为荧光探针用于血吸虫尾蝴荧 光标记的研究，可以成功地解决尾蝴荧光成像过程中自发荧光干扰与光漂白的问题。
【附图说明】
[0014] 图1配合物Ir-I的吸收光谱和磷光发射光谱。
[0015] 图2配合物Ir-2的吸收光谱和磷光发射光谱。
[0016] 图3配合物Ir-3的吸收光谱和磷光发射光谱。
[0017] 图4配合物Ir-4的吸收光谱和磷光发射光谱。
[0018] 图5配合物Ir-5的吸收光谱和磷光发射光谱。
[0019] 图6.配合物Ir-I标记日本血吸虫尾蝴的激光共聚焦荧光成像图。
[0020] 图7.配合物Ir-4标记日本血吸虫尾蝴的激光共聚焦荧光成像图。
[0021] 图8.配合物Ir-5标记日本血吸虫尾蝴的激光共聚焦荧光成像图。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
[0023] 下文给出了本发明化合物的具体实施例，但对本发明不构成任何限制。本实施例 中所用的原料均为已知化合物，可以由商业途径获得，或可按相关文献设计方法合成。
[0024] 在下述实施例中，所涉及的理化参数由下述仪器测定的=1H NMR谱在Bruker Mercuryplus 核磁仪上米用 400 MHz 测定；质谱数据在 Applied Biosystems VOYGER DE-STR型质谱仪上测得；紫外可见吸收光谱在Shimadzu UV-2700型紫外-可见吸收光谱 仪上完成；磷光发射光谱由PerkinElmer LS-55荧光光谱仪测定；尾蝴磷光成像在OLYMPUS FV1000型激光共聚焦荧光显微镜上进行，激光器提供波长为405 nm和515nm的激发光源， 根据不同铱配合物的磷光性质收集500 nm-700 nm范围内的发射信号进行荧光成像。
[0025] 实施例1
(1) ΗΟ-bt的合成：将I mmol的4-苯酸硼酸，I mmol的2-氯苯并噻唑，7%当量的四 (3-苯基膦）钯（0)和I mmol的碳酸钾加入到三颈烧瓶中，然后加入30 mL THF和氏0(乂/ V=I :1)的混合溶剂。在氮气的保护下，反应体系在70 °C反应24 h。冷却至室温，反应液 用二氯甲烷萃取，水相用二氯甲烷萃取3次（10 mL X 3)，合并有机层，用无水硫酸钠干燥， 减压除去溶剂后柱层析分离得到产物。
[0026] (2)三缩二乙二醇单端酯的合成：将Immol三缩二乙二醇加入三颈烧瓶中，加入1 mmol的吡啶，用20 ml的二氯甲烷溶解。在0 °C冰浴中搅拌。用二氯甲烷将Immol对甲基 苯磺酰氯溶解，缓慢滴入三颈烧瓶中。反应3 h后用盐酸洗涤，取有机层加水洗至水溶液呈 中性。无水硫酸钠干燥，柱层析分离得到产物。
[0027] (3)配体PEG-bt的合成：将I mmol三缩二乙二醇单端酯，I mmol碳酸钾，10%当 量的四丁基溴化铵加入三颈瓶中，用20 ml的乙腈溶解。在80°C油浴中搅拌回流。缓慢 滴入乙腈溶解的I mmol ΗΟ-bt。反应10 h后，冷却至室温。反应液用二氯甲烧萃取，水相 用二氯甲烷萃取3次（10 mL X3)，合并有机层，用无水硫酸钠干燥，柱层析分离得到配体 PEG-bt〇
[0028] (4) PEG-bt 铱二氯桥配合物的合成(参见文献1'1〇11〇5^1]^，1(.131111.〇16111.3〇(3· Jpn. 1974，47，467-468.)。
[0029] 0. 5 mmol的三氯化铱水合物和I mmol的配体PEG-bt溶于25 mL的2-乙氧基乙 醇和水的混合液中（v/v=3 :1)，110 °C反应24 h，室温冷却。抽滤收集固体，分别用蒸馏水 和无水乙醇洗涤数次，即得PEG-bt铱二氯桥配合物。
[0030] (5) [Ir(PEG_bt)2(bpy)] [PF6] (Ir-I)的合成：将 0· 2 mmol 的 PEG-bt 铱二氯桥 配合物，0.4 mmol的1，10-邻菲罗啉加入圆底烧瓶中，然后加入30 mL二氯甲烷和甲醇（v/ v=2:l)。在氮气的保护下，反应体系在50 °C反应10 h。再加入10倍当量的KPF6，继续反 应4 h。室温冷却，抽滤收集液体，减压除去溶剂后柱层析分离得到产物。核磁表征数据： 1H NMR (400 MHz, DMS0) δ 8.94 (dd, / = 8. 3, 1.3 Hz, 2H), 8.48 (dd, J= 5.1, 1.2 Hz, 2H), 8.33 (s, 2H), 8.13 (dd, / = 8. 3, 5.1 Hz, 2H), 8.08 (d, J= 7.8 Hz, 2H), 8.02 (d, /= 8.6 Hz, 2H), 7.23 (dd, J= 11.8, 4.5 Hz, 2H), 6.90 - 6.85 (m, 2H), 6.82 (dd, /=8.7, 2.4 Hz, 2H), 5.80 (d, / = 2.4 Hz, 2H), 5.66 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.53 (t, / = 5. 5 Hz, 2H), 3.53 (t, / = 4.6 Hz, 4H), 3.45 - 3.39 (m, 12H), 3. 36 - 3.30 (m, 8H).配合物Ir-I的吸收光谱和荧光光谱如图I所示。
[0031] 实施例2
[Ir(CH0-ppy)2(phen)] [PF6] (Ir-2)的合成：
(1)配体CHO-ppy的合成：将I mmol的4-醛基苯硼酸，I mmol的2-氯P比啶，7%当量 的四（3-苯基膦）钯（0)和I mmol的碳酸钾加入到三颈烧瓶中，然后加入50 mL 1'册和氏0 (V/V=l:l)的混合溶剂。在氮气的保护下，反应体系在70 °C反应24 h。冷却至室温，反应 液用二氯甲烷萃取，水相用二氯甲烷萃取3次（10 mL X3)，合并有机层，用无水硫酸钠干燥 过夜，减压除去溶剂后柱层析分离得到CH〇-ppy。
[0032] (2)CH0_ppy 铱二氯桥配合物的合成(参见文献1'1〇11〇5^1]^，1(.131111.〇16111.3〇(3· Jpn. 1974，47，467-468.)。
[0033] (3)将0· 25 mmol的CH〇-ppy铱二氯桥配合物，0· 5 mmol的1，10-邻菲罗啉加入 圆底烧瓶中，然后加入30 mL的二氯甲烷和甲醇（v/v=2:l)。在氮气的保护下，反应体系在 50 °C反应10 h。再加入10倍当量的KPF6，继续反应4 h。反应结束冷却至室温，抽滤收集 液体，减压除去溶剂后柱层析分离，所得即为产物。核磁表征数据：? NMR (400 MHz，DMS0) δ 9.75 (s, 2H), 8.91 (d, J= ?Λ Hz, 2H), 8.46 (d,