大黄鱼C凝集素Nattectin基因及其重组蛋白和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物凝集素，尤其是涉及一种大黄鱼C凝集素 Nattectin基因及其重 组蛋白和应用。
【背景技术】
[0002] 大黄鱼是我国养殖量最大的海水经济鱼类之一，每年直接产值达数十亿元。但近 年来由于养殖密度的增大和海水污染程度的加重，导致疫病频发，严重阻碍了大黄鱼养殖 业的健康发展，导致了巨大的经济损失。目前对于大黄鱼疾病的防治主要采用化学药物，如 抗生素类。但由此造成病原菌抗药性增强、水产品药物残留超标和环境污染严重等一系列 问题。因此，寻找一种环境友好、切实可行的免疫防治方法、促进我国大黄鱼养殖业的可持 续发展已成为当前海水养殖业关注的焦点。
[0003] C型凝集素是最早发现的动物凝集素之一。与其他凝集素所不同的是C型凝集 素含有一个保守的糖基识别结构域（CRD)，可专一地与异物表面特定的糖基结合并吸附、 凝集异物，从而促进机体清除异物。近年，C型凝集素作为模式识别受体受到国内外学 者的广泛关注，其在动物的免疫防御系统中发挥了重要作用，包括凝集、吞噬、抗病毒、诱 导酸氧化酶系统的激活和激发呼吸爆发等（Dambuza IM and Brown⑶.C-type lectins in immunity:recent developments. Curr Opin Immunol. 2015. 32:21-27) 〇 -般 C 型凝 集素分为两类：一类是甘露糖特异性C型凝集素，能够特异性结合甘露糖和/或海藻糖 终止的多糖；另一类是半乳糖特异性C型凝集素，能够特异性识别半乳糖和N-乙酰氨基 半乳糖终止的多糖（Weis WI, et al. The C-type lectin superfamily in the immune system. Immunol Rev. 1998, 163:19e34)。Nattectin属于后者，其最早分离于有毒的纳氏 海蟾鱼（Thalassophryne nattereri)，具有凝集红细胞的作用，并可以激活老鼠的嗜中性 粒细胞，说明其具有免疫调节的功效（Saraiva TC et al. Structural and biological characterization of Nattectin, a new C-type lectin from the venomous fish Thalassophryne nattereri. Int Immunopharmacol. 2011，11:1546-1556) 〇 但是，迄今尚未 有Nattectin的细菌凝集作用的报道，本发明为首例发现Nattectin的细菌凝集作用。
[0004] C型凝集素重组蛋白，大多以包涵体的形式存在，包涵体存在复性困难且很难保持 生物学活性等问题，因此，在实际应用中受到很大程度的限制。本发明采用一步脱盐法就可 以同时达到蛋白复性和脱盐的目的。实验操作简单，蛋白产量高，使低成本的规模化生产成 为可能，为研制新型鱼类免疫添加剂和细菌防治药物提供了一种新的途径。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一目的在于提供大黄鱼C凝集素 Nattectin的蛋白和核苷酸序列。
[0006] 本发明的第二目的在于提供大黄鱼C凝集素 Nattectin重组蛋白的制备方法。
[0007] 本发明的第三目的在于提供大黄鱼C凝集素 Nattectin重组蛋白在介导细菌凝集 中的应用。
[0008] 本发明的第四目的在于提供大黄鱼C凝集素 Nattectin重组蛋白在介导红细胞凝 集中的应用。
[0009] 所述大黄鱼C凝集素 Nattectin的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。
[0010] 所述大黄鱼C凝集素 Nattectin基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。
[0011] 所述大黄鱼C凝集素 Nattectin重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0012] (1)构建pET_32a_Nattectin重组表达载体，其具体方法如下：
[0013]用2条特异性引物扩增Nattectin基因开放阅读框，并将其插入表达载体的 pET-32aBamH I和EcoR I多克隆位点间，经酶切鉴定和测序证明构建表达载体成功；
[0014] 所述2条特异性引物为：
[0015] 正向引物 PF: CCGGAATTCATGGCATCAGCTCTTCATTTCA ；
[0016] 反向引物 PR: CCGCTCGAGTTGTAAGGCGTCCTTGGCAC ；
[0017] 划线部分为BamH I和EcoR I内切酶位点；
[0018] (2)获得转化子高拷贝的大肠杆菌表达菌株pET-32a-Nattectin-BL21，其具体方 法可为：
[0019] 经热转化，氨苄青霉素筛选，获得阳性克隆菌株pET-32a-Nattectin-BL21。
[0020] (3)转化子的发酵培养与诱导表达；
[0021] 诱导表达条件为：菌液0D600值0· 6~0· 8,0· ImM的IPTG，18°C，90rpm过夜诱导 12h〇
[0022] (4)重组蛋白Nattectin的纯化和复性，具体方法如下：
[0023] 用镍离子柱纯化包涵体重组蛋白，再复性得到可溶性蛋白。
[0024] 在步骤⑷中，所述用镍离子柱纯化包涵体重组蛋白的洗脱液配方可为： 160mMimidazole，8M Urea，IOOmM NaH2PO4, IOmM Trisbase，pH 8. 0 ;所述复性可米用一步脱 盐法复性，即脱盐柱直接对纯化的包涵体脱盐，可同时达到复性和脱盐的目的，最终得到溶 于PBS的重组蛋白。
[0025] 所述大黄鱼C凝集素 Nattectin重组蛋白可在介导细菌凝集中应用。
[0026] 所述大黄鱼C凝集素 Nattectin重组蛋白可在介导红细胞凝集中应用。
[0027] 本发明具有如下有益效果：
[0028] 本发明提供的Nattectin基因和蛋白序列为新型C凝集素，仅在有毒的纳氏海瞻 鱼（T.nattereri)报道过，本发明为首次发现Nattectin凝集素具有细菌凝集活性。
[0029] 本发明表达的重组蛋白Nattectin具有广谱凝集水产动物病原菌的作用，从而一 方面把病原菌局限在一定范围内，限制病原菌继续侵染机体其他部位；另一方面可以促进 机体快速清除病原菌。此外，表达的重组蛋白Nattectin对人类、家兔和大黄鱼血细胞具有 凝集作用。
[0030] 与以往天然获得凝集素或者体外表达凝集素技术相比，本发明的制备方法具有以 下优点：①操作简单：规模化生产时只需培养已诱导表达重组蛋白的细菌即可。②蛋白产 量高：因为蛋白以包涵体形式存在，产量非常高。③纯化操作简单且蛋白稳定：由于包涵体 外有一层膜包裹，故纯化的时候蛋白不易散落，且容易与镍离子柱结合，故纯化操作简单、 蛋白稳定。④复性简单：本发明首次发现一步脱盐法即可获得可溶性的生物活性蛋白，这 在包涵体蛋白复性中是非常简单易行的，因为通常包涵体复性都是梯度尿素复性（即6、4、 2、1、0M尿素复性，此操作工序繁琐，很难获得具有生物活性的蛋白）。综上所述优势，使得 C凝集素 Nattectin重组蛋白大批量，低成本的规模化生产成为可能，为研制新型鱼类免疫 添加剂和细菌防治药物提供了一种新的途径。
[0031] 重组蛋白对革兰氏阳性和阴性菌（包括多种水产动物致病菌）具有广泛的凝集 作用。对大肠杆菌（Escherichia. Coli)、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus)、溶 藻弧菌（V.alginolyticus)、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)和溶壁微球菌（Micrococcus Iysoleikticus)的最小凝集浓度 分别为 2· 12、2· 12、0· 266、1· 06、2· 66、0· 0664μg/ml。
[0032] 重组蛋白对人、家兔和大黄鱼红细胞具有明显的凝集作用。最小凝集红细胞的浓 度为 18. 75、37· 5 μ g/ml，18. 75 μ g/ml。
[0033] 本发明采用一步脱盐法就可以同时达到蛋白复性和脱盐的目的。实验操作简单， 蛋白产量高，使低成本的规模化生产成为可能，为研制新型鱼类免疫添加剂和细菌防治药 物提供了一种新的途径。
【附图说明】
[0034] 图1为本发明的C凝集素 Nattectin在大肠杆菌诱导表达的重组蛋白及纯化电泳 图。在图1中，Lane M :蛋白Marker ;Lane 1 :重组菌株未诱导；Lane 2 :诱导的总蛋白；Lane 3:诱导蛋白的上清液；Lane 4:诱导蛋白的沉淀；Lane 5:纯化的重包涵体蛋白；Lane 6: 脱盐后溶于PBS的重组蛋白。
[0035] 图2为本发明的C凝集素 Nattectin对大肠杆菌（E. Coli)、副溶血弧菌 (V. parahaemolyticus)、溶藻弧菌（V. alginolyticus)、嗜水气单胞菌（A. hydrophila)、金 黄色葡萄球菌（S. aureus)和溶壁微球菌（M. Iysoleikticus)的凝集作用。在图2中，左图 为BSA阴性对照组，右图为Nattectin凝集组。
[0036] 图3为C凝集素 Nattectin对人、家兔和大黄鱼红细胞的凝集作用。在图3中，左 图为BSA阴性对照组，右图为Nattectin凝集组。
【具体实施方式】
[0037] 以下结合实施例进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
[0038] 实施例1
[0039] 大黄鱼C凝集素 Nattectin cDNA序列的获得
[0040] 1.大黄鱼脾脏总RNA的提取和反转录cDNA的合成
[0041 ] 用Trizol试剂抽提大黄鱼脾脏总RNA，用1 %琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性， 用紫外分光光度法检测RNA的浓度和纯度。用M-MLV反转录酶试剂盒反转RNA，得到cDNA 第一条链。
[0042] 2.获得大黄鱼C凝集素 Nattectin cDNA序列
[0043] 根据本实验室大黄鱼转录组数据库拼接Nattectin基因序列，并设计一对特异性 引物扩增获得大黄鱼C凝集素 Nattectin。引物序列为：
[0044] 正向引物 NF: ATGGCATCAGCTCTTCATTTCA ;
[0045] 反向引物 NR: TTGTAAGGCGTCCTTGGCAC。
[0046] PCR反应程序为：94°C预变性3min，然后30个循环：94°C变性45s，70°C退火45s， 72°C延伸45s ;最后72°C延伸lOmin。纯化的PCR产物与载体pMD-19T相连，筛选阳性克隆 子并测序。
[0047] 应用BLAST工具将大黄鱼Nattectin的核苷酸和氨基酸序列与NCBI数据库已 有的Nattectin基因/蛋白比对，发现本发明所述的大黄鱼Nattectin与已有大黄鱼 Nattectin的核苷酸序列相差4个碱基SEQ ID N0:2,并且相差一个氨基酸序列SEQ ID NO: 1〇
[0048] SEQ ID NO: 1的信息（参见序列表，下划线为相差的氨基酸序列）
[0049] MASALHFIVLLCGLWIGANVISAHHLGGCPHRWTKHGCRCFRFFNTPKPWAEAERFCTLHGGNLAS VLTREEGNLISSMMTTTAWVGGYDKVQDGVWLWSDGRKFDFHLWRK