木糖醇和乙醇同时高温高产工程菌株的构建及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地说，构建了能够在较高温度下同时利用葡萄糖 和木糖共发酵生产乙醇和木糖醇，并且生产速率大幅度提高的耐热工程酵母。涉及通过工 程菌改造提高高温下利用葡萄糖和木糖共发酵生产乙醇和木糖醇的领域。
【背景技术】
[0002] 木糖醇是一种五碳多元醇，是木糖代谢的正常中间产物（Vandeska et al.，1996)，它的性质决定了它在食品、医药等方面具有重要的应用价值。首先，在食品行 业中，木糖醇的甜味堪比蔗糖，可以作为甜味剂，同时与其它甜味剂相比，木糖醇的口感清 凉，而且木糖醇不能被口腔内酵母菌和细菌利用，因此可以预防龋齿，可作为儿童防蛀食品 的添加剂（Dominguez et al.，1997)。另外，由于木糖醇是微生物的不良培养基，因此可以 作为食品添加剂，延长食品的保鲜期。其次，在医药方面，它被用于静脉滴注时，不需要胰 岛素的促进作用，就可以透过细胞膜，促进肝糖元的增加，为细胞提供所需的能量，同时血 液中的丙酮酸、乳酸以及葡萄糖的含量会有所下降，无细胞毒性，因此可以作为糖尿病患者 的辅助治疗试剂（Ahmad et al·，2011 ;Ghindea et al·，2010 ;Jeon et al·，2011 ;Ko et al. , 2011 ；Kumar et al. , 2009 ；Sasaki et al. , 2010)〇
[0003] 木糖醇是木糖代谢的正常中间产物（Vandeska et al.，1996)。目前木糖醇的生产 主要是通过工业生产的方式。工业生产主要是化学加氢法，加氢需要高温高压，增加了生产 成本，同时工艺复杂、收率低，限制了木糖醇的大规模生产，并且加氢需要镍的催化作用，这 就带来了低食品安全和环境污染的隐患（Cheng et al.，2010)。针对化学法生产木糖醇存 在的问题，国际上从20世纪70年代开始研究用微生物法来生产木糖醇。微生物法的原理 是利用细胞内的木糖还原酶（XR)，将木糖还原为木糖醇，而不需要镍的催化作用，保证的食 品安全却又不会带来环境污染；氢来自细胞内的还原性辅酶和氢离子，不需另行制氢，反应 在常温常压下进行，降低了成本。又由于酶的底物专一性，使得原料不必高度精制。因此， 利用微生物来生产木糖醇将具有污染少、成本低、产品质量高并且无环境污染等优点，具有 非常大的发展前景。
[0004] 乙醇是醇类的一种，俗称酒精。乙醇的用途很广，在生物能源方面，由于它存在作 为化石燃料的替代者的潜力，因此在近年受到了很大的关注（Chen，2011)。乙醇调入汽油可 以作为车用燃料，也被称为E型汽油，这样的调和可以优化油品的性能和质量，从而降低一 氧化碳、碳氢化合物等主要污染物排放。在医药方面，乙醇是一种镇静剂，也可以用于医药 消毒。在食品方面，食用酒精可以用来勾兑白酒。另外，乙醇在化工行业也有重要的用途，可 以用作溶剂，作为有机合成的原料，用于各种化合物的结晶，还可以作为洗涤剂和萃取剂。
[0005] 目前乙醇的生产包括工业生产和微生物生产两种方式。工业生产是将乙烯与水合 成乙醇，而乙烯大量取自石油裂解气，所以这种方法会受到石油资源的限制。另外，还需要 高温高压的条件，使乙醇的工业生产面临高成本与环境污染的压力。而利用微生物发酵糖 类生产乙醇，是一种可利用再生资源的生产方法，不仅能够满足对燃料等方面的需求，还可 以避免环境污染（Su et al.，2014)。因此目前越来越多的采用的是利用微生物生产的方式 的生产乙醇
[0006] 本专利中用来生产木糖醇的菌株为马克斯克鲁维耐热酵母K. marxianus。 K.marxianus在高温下发酵有以下几个优点：1.高温下发酵可以降低发酵中的冷却费 用；2.纤维素酶等的最适催化温度较高，高温会提高以淀粉、纤维素等生物质为原料的同 步糖化发酵（SSF)效率，促进糖化，减少在酶上的费用（Fonseca et al.，2008) Zhang et al.，2013) ;3.能在耐热范围内生存的微生物较少，因此，高温会降低污染的风险。（Kumar et al.，2009 ;Zhang et al.，2013)。除此之外，Κ· marxianus 是一种 GRAS (general regarding as safe)酵母，广泛的在乳制品、葡萄酒发酵制造中存在，对环境、动物及人类 是安全的微生物。它能够在较高的温度下生长，最高的菌株可在高达52°C生长，具有很高 的生长速率（〇· 86 - 0· 99h \ 40°C ) (Banat and Marchant, 1995)。K. marxianus 有很高的 代谢多样性，能利用多种工业上的底物糖类生长发酵。能利用多种廉价底物、耐热、高生长 率等特点，使其被认为是替代酿酒酵母用来进行工业发酵和外源蛋白表达的候选者。由于 K. marxianus有很多比酿酒酵母优秀的品质，K. marxianus被越来越多的用于生物能源的 生产（Fonseca et al.，2008)。所以利用K. marxianus发展成木糖醇生产菌株有非常重要 的应用价值。
[0007] 木质纤维素生物质（如农业废物玉米秸杆等）是丰富的可再生材料，同时木质纤 维素可以从农业废物如玉米秸杆等中获得，不会与粮食造成竞争。因此，利用生物从可再生 资源中生产有价值的产物木糖醇具有极大的经济和环境意义。葡萄糖和木糖是其水解液 的最主要两个单糖成份，要建立经济的工业利用过程，需要对两种糖的高效利用和发酵（Ha et al.，2011)，但目前的方法都不够高效，尤其是葡萄糖和木糖同时存在时，由于葡萄糖抑 制效应，微生物利用木糖的能力常常被葡萄糖抑制而导致效率低下。各种工程菌株的构建， 使利用木糖发酵生产木糖醇的能力不断提高，但是葡萄糖的抑制效应常常难以解除。在构 建的马克思克鲁维酵母菌株葡萄糖的抑制效应非常明显，因此利用葡萄糖和木糖共同发酵 一直是一个瓶颈。
【发明内容】
[0008] 本专利通过基因工程改造，最终获得菌株YZJl 19,可以同时利用葡萄糖和木糖共 发酵，在高温下同时利用葡萄糖和木糖的混合糖溶液生产木糖醇和乙醇，并在不影响乙醇 产量的前提下大幅度提高木糖醇的得率及生产速率，在利用木质纤维素生物质水解产物高 效生物转化生产木糖醇和乙醇工业上有很巨大的应用前景。
[0009] 本发明通过基因工程的方法，首先在耐热酵母YZJ015中高效表达酿酒酵母的半乳 糖透过酶的N376F突变体（从酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303_1A(ATCC208352) 基因组中利用带有突变位点的引物扩增并融合得到）（具体构建过程为PZJ061和 PZJ063)，从而使菌株共利用和发酵葡萄糖和木糖的能力大幅度的提高。其次，敲除基因 KmGPDl (GenBank，K. marxianus 基因组序列 AP012213, REGION: 378475. · 379641)从而切断 甘油生产支路，使甘油的积累几乎消失。构建了在较高温度（>42°C)下能够同时共利用和 发酵葡萄糖和木糖的高效生产乙醇和木糖醇的耐热酵母K. marxianus菌株YZJ119。
[0010] 本专利中的最终构建的YZJ119菌株在42°C条件下，以83. llg/Ι葡萄糖和 43. 95g/l木糖的混合糖为底物，YZJ119能在28h内生产40. 43g/l木糖醇，生产速率为 I. 44g/l/h，生产率为0. 92g/g，同时生产34. 66g/l乙醇，生产速率为I. 24g/l/h，生产率为 0.42g/g〇
[0011] 本发明具体包括以下各项：
[0012] 1. 一种能同时利用葡萄糖和木糖共发酵生产木糖醇和乙醇的耐热工程酵母菌 株，所述酵母菌株以在K. marxianus基础上转入了一个以上拷贝的脉孢霉木糖还原酶基因 NcXR(Neurospora crassa xylose reductase)的耐热酵母作为宿主，并将一个以上拷贝的 酿酒酵母的半乳糖通透酶的N376F突变体基因在上述所述宿主中重组表达，和任选地敲除 基因 KmGPDl而获得。
[0013] 2.根据1所述的酵母菌株，所述NcXR的拷贝数为四个。
[0014] 3.根据1所述的酵母菌株，所述宿主为保藏号为CGMCC No. 7819的YZJ015菌株。
[0015] 4.根据1所述的酵母菌株，所述半乳糖通透酶的N376F突变体基因的拷贝数为一 个、两个、三个或四个。
[0016] 5.根据1所述的酵母菌株，所述半乳糖通透酶的N376F突变体基因的序列为SEQ ID NO ：15〇
[0017] 6.根据1所述的酵母菌株，所述菌株为马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus)YZJ119,已经于2015年7月2日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会的普通 微生物中心，保藏号为CGMCC No : 11035。
[0018] 7. -种能同时利用葡萄糖和木糖共发酵生产木糖醇和乙醇的耐热工程酵母菌株 的构建方法，所述方法包括：
[0019] 1)敲除在K. marxianus基础上转入了一个以上拷贝的脉孢霉木糖还原酶基因 NcXR(Neurospora crassa xylose reductase)的耐热酵母中的 ScURA3 基因；
[0020] 2)顺序转入一份、两份、三份或四份半乳糖通透酶的N376F突变体基因；和任选地
[0021] 3)敲除基因 KmGPDl。
[0022] 8.根据7所述的方法，所述NcXR的拷贝数为四个。
[0023] 9.根据7所述的方法，所述耐热酵母为保藏号是CGMCC No. 7819的YZJ015菌株。
[0024] 10. 1-6任一项所述的酵母菌株用于将葡萄糖和木糖共发酵生产木糖醇和乙醇的 方法。
[0025] 在优选的实施方案中，本发明包括以下内容：
[0026] 1). 一种能同时利用葡萄糖和木糖共发酵生产木糖醇和乙醇的耐热工程酵母菌 株，以在K. marxianus基础上转入了四个拷贝的NcXR的耐热酵母YZJ015菌株（CGMCC No. 7819)作为宿主，并将多拷贝的酿酒酵母的半乳糖通透酶的N376F突变体基因在上述所 述宿主中重组表达。
[0027] 2).第1)项中的半乳糖通透酶的N376F突变体基因的重组表达的出发载体为 YEUGAP(Zhang et al.，2015)或 pPICZ B(invitrogen)。本专利中的各种质粒的构建为： ⑴以酿酒酵母的基因组DNA为模板，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶（大连宝生物）进行 PCR扩增，得到的产物即为ScGAL2,并将基因连接进入YEUGAP载体中，从而构建得到质粒 PZJ050。⑵以pZJ050作为模板，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶（大连宝生物）进行PCR扩 增，得到的产物即为ScGAL2-Fl，ScGAL2-F2两个基因片段，将两个基因片段融合，并将融合 的基因片段ScGAL2-N376F连接进入YEUGAP载体中，从而构建了质粒pZJ061。⑶将终止子 ScGAPDHt,启动子 KmGAPDHp 和 ScGAL2-N376F 基因分别以 YEGAP 质粒，pMD18-T-KmGAPDHp 质粒（Zh