双脂肪酶细胞表面共展示工程菌及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学、生物质能源以及基因工程等技术领域，具体涉及一种双 脂肪酶细胞表面共展示工程菌及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 脂肪酶（Lipase，EC3. 1. 1. 3)是与甘油三酯的水解、合成及转酯化有关的酶类，广 泛存在于动、植物和微生物中，其最显著的特点是能在油-水界面上催化反应。脂肪酶作 为一种绿色催化剂已成功应用于油脂加工、有机合成、化妆品及医药等领域，近年来在制备 生物柴油的研究中亦得到广泛应用。在以真菌为来源的脂肪酶中，南极假丝酵母脂肪酶 B(CandidaantarcticalipaseB，CALB)具有化学选择性与对映选择性，对非水溶性和水 溶性物质都有很强的催化活性。米根霉脂肪酶（Rhizopusoryzaelipase，R0L)作为一 种1，3-位特异性脂肪酶，可以很好的在无有机溶剂存在的水相中催化油脂的转酯化反应， 是全细胞法和酶法生产生物柴油的主要脂肪酶之一。在催化油脂转酯化的效果方面，南极 假丝酵母脂肪酶B催化活性高，反应时间短，但其水相催化效果欠佳，米根霉脂肪酶具有 1，3-位特异性并能很好的在水相中发挥催化作用。
[0003] 近年来，在生物柴油的研究中，以脂肪酶为催化剂的生物催化法因其具有比化学 法反应条件温和、醇用量小、后处理简单、无污染物排放等优点而越来越受到重视，尤其是 采用固定化酶催化，使得反应结束后催化剂易回收，可多次循环利用，大大降低了生产成 本，显示出良好的应用前景。但是，酶催化方法存在着酶的提取分离和纯化过程复杂及高成 本、酶在制备过程中易产生活性损失等问题，因而近年来直接以脂肪酶生产菌株或细胞为 催化剂的全细胞生物催化方法已成为一个重要的发展方向，尤其近些年发展起来的微生物 细胞表面展示技术为全细胞催化及酶的固定化提供了一种新的基于基因重组技术的生物 学方法。
[0004] 微生物细胞表面展示是通过将靶蛋白基因序列与特定的载体蛋白基因序列融合 后导入微生物宿主细胞，靶蛋白在载体蛋白的引导下表达并定位于微生物细胞表面，保持 相对独立的空间构象和原有的生物学活性。利用表面展示技术将具有催化活性的酶展示于 酵母等微生物细胞表面就形成了全细胞催化剂。与传统的细胞内酶和外分泌酶不同，表面 展示的酶以共价或非共价键形式固定于细胞外表面，因而具有许多优良的特性，如温度、有 机溶剂稳定性、可重复利用等。目前，微生物表面展示系统已发展出噬菌体展示系统、细菌 表面展示系统、酵母表面展示系统等，广泛应用在生物学研究及工业生产的许多领域。
【发明内容】
[0005] 发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种双脂肪酶细胞 表面共展示工程菌，以酿酒酵母为来源的细胞壁蛋白Sedlp为锚定蛋白，将米根霉脂肪酶 和南极假丝酵母脂肪酶B共展示于毕赤酵母GS115细胞壁表面，并实现高效表达。本发明 的另一目的是提供一种上述双脂肪酶细胞表面共展示工程菌的构建方法。本发明还有一目 的是提供一种上述双脂肪酶细胞表面共展示工程菌的应用。
[0006] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下是：
[0007] -种双脂肪酶细胞表面共展示工程菌，为以酿酒酵母细胞壁蛋白Sedlp作为锚定 蛋白，以米根霉脂肪酶和南极假丝酵母脂肪酶B为双脂肪酶靶蛋白，共同展示在毕赤酵母 细胞表面，构建出的双脂肪酶细胞表面共展示重组酵母工程菌。
[0008] 所述的双脂肪酶细胞表面共展示工程菌的构建方法，以Sedlp为锚定蛋白，使其 与米根霉脂肪酶N端连接，通过该锚定蛋白的N端重复序列，以共价键方式，将米根霉脂肪 酶R0L固定于毕赤酵母细胞表面，实现诱导表达，得到单独展示米根霉脂肪酶的重组酵母； 再将该单独展示米根霉脂肪酶的重组酵母制备成感受态细胞，将构建的南极假丝酵母脂肪 酶B表达质粒pGAPZaA-CALB-Flag-Sedlp电转化至单独展示R0L的重组酵母感受态细胞 中，筛选得到表面共展示R0L和CALB的重组酵母阳性转化子。
[0009] 所述的双脂肪酶细胞表面共展示工程菌的构建方法，包括以下步骤：
[0010] (1)将靶蛋白米根霉脂肪酶R0L的基因序列克隆到表达载体中，得到表面展示重 组质粒载体；再将锚定蛋白基因Sedlp克隆到表面展示重组质粒载体中，使酿酒酵母细胞 壁蛋白基因与靶蛋白米根霉脂肪酶基因形成融合基因，得到以酿酒酵母细胞壁蛋白Sedlp 为锚定蛋白的米根霉脂肪酶细胞表面展示表达质粒；
[0011] (2)将米根霉脂肪酶细胞表面展示表达质粒电转化至巴斯德毕赤酵母，根据表达 载体上的筛选标记筛选得到单独展示米根霉脂肪酶的重组毕赤酵母阳性转化子；
[0012] (3)将单独展示米根霉脂肪酶R0L的重组酵母制备成感受态细胞。
[0013] (4)采用与步骤⑴相同的方法构建南极假丝酵母脂肪酶B的细胞表面展示表达 质粒pGAPZaA-CALB-Flag-Sedlp，将pGAPZaA-CALB-Flag-Sedlp电转化至单独展示米根 霉脂肪酶的重组酵母感受态细胞中，通过阳性转化子筛选得到米根霉脂肪酶R0L与南极假 丝酵母脂肪酶B细胞表面共展示的重组酵母细胞。
[0014] 所述的双脂肪酶细胞表面共展示工程菌做为双脂肪酶细胞表面共展示型全细胞 催化剂在催化油脂转酯化制备生物柴油中的应用。
[0015] 所述的应用，催化转酯化制备生物柴油的油脂原料为大豆油、菜籽油、小桐子油或 麻风树籽油、橡胶籽油等植物油脂，也可以为微藻油脂，也可以为餐饮废弃油脂。
[0016] 本发明的米根霉脂肪酶与南极假丝酵母脂肪酶B细胞表面共展示型全细胞催化， 可结合两种酶所具备的在水相中催化效率高和催化反应时间短等优点，比现有的固定化酶 催化、非表面展示型全细胞催化和单一脂肪酶表面展示型全细胞催化具有更为显著的优 点，必将成为油脂催化转酯化制备生物柴油领域的最新发展趋势。因此，结合基因工程技术 和细胞表面工程技术研究脂肪酶细胞表面共展示型全细胞催化剂是极其必要的。
[0017] 有益效果：与现有技术相比，本发明将米根霉脂肪酶与南极假丝酵母脂肪酶B共 展示于毕赤酵母细胞壁表面，制备了米根霉脂肪酶与南极假丝酵母脂肪酶B细胞表面共展 示型全细胞催化剂，该表面共展示型全细胞催化剂最高酶活为686U/g_细胞干重，分别是 单独展示米根霉脂肪酶或南极假丝酵母脂肪酶B的酶活力的3倍和2倍，催化油脂转酯化 反应甲酯得率达96%。
【附图说明】
[0018] 图1是重组质粒构建图；
[0019] 图2是平板筛选高产脂肪酶的表面共展示重组菌株图；其中，（a)三辛酸甘油酯平 板，（b)橄榄油-MMH-RB平板；
[0020] 图3是表面共展示重组基因工程菌的荧光分析结果图；其中，1.白光，2. 488nm， 3. 555nm；
[0021] 图 4 是Westernblot分析结果图；其中，lane2，（a);lane1，（b)为表面 共展示重组菌GS115/pGAPZA-RCS细胞壁蛋白；lane3，（a)为ROL表面展示重组菌 GS115/pPICZaA-R0L-Sedlp细胞壁蛋白，lane2,（b)为CALB表面展示重组菌GS115/ pGAPZaA-CALB-Sedlp细胞壁蛋白，lane1，（a);lane3,（b)为毕赤酵母GS115 细胞壁蛋 白；
[0022] 图5是表面共展示脂肪酶的酶活力结果图；其中，表面共展示重组菌GS115/ pGAPZaA-RCS的脂肪酶活力；R0L表面展示重组菌GS115/pGAPZaA-CALB-Sedlp的脂 肪酶活力；CALB表面展示重组菌GS115/pPICZaA-ROL-Sedlp的脂肪酶活力；
[0023] 图6是表面共展示型全细胞催化剂催化大豆油转酯化反应的甲酯得率图；
[0024] 图7是表面共展示型全细胞催化剂的重复使用性能图。
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例所使用的培养基和相关试剂如下：
[0026] 10XYNB(1L):溶解134gYNB(含硫酸铵不含氨基酸）于1LddH20中，在50°C以下 溶解。
[0027]BMGY(IL):溶解 10g酵母提取物、20g蛋白胨于 700mLddH20 中，121°C灭菌 20min， 冷至室温，加入 100mLlmol/L磷酸钾缓冲液（pH6.0)，100mL10XYNB，2mL500XB，100mL 10