肺动脉高压治疗药物的干细胞筛选模型及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于应用干细胞技术建立肺动脉高压新型治疗药物筛选方法的技术邻域。
【背景技术】
[0002] 肺动脉高压（PAH)是由于肺小动脉原发病变而导致的肺动脉阻力增加，是一种少 发但高致死率的病症。肺血管阻力进行性升高，最终导致患者右心衰竭而死亡。其主要病 理特征是严重肺血管重构，包括内皮功能紊乱和平滑肌细胞增殖所致的小肺动脉内膜纤维 化，中膜肥厚，外膜增生，丛样病变及动脉管腔闭塞。在过去20年里包括前列环素和其类似 物，内皮素受体拮抗剂，磷酸二酯酶抑制剂在内的几类新药已经批准上市，但3年死亡率仍 然在40%左右。并且这些治疗方案主要针对减轻血管紧张而达到治疗效果。因此我们迫切 需要研发改善血管重构，延缓肺动脉高压病程，提高患者生存率为目的的药物。
[0003] 优化设计PAH理性治疗方案应基于对此疾病细胞分子机理的透彻认识。研究表 明肺动脉高压中存在着BMP二型受体（BMPRII)表达缺陷和Id基因表达下调[YangJat alCirculationReserch2008,102:1212-1221]。恢复生理水平BMP信号，尤其是血管细 胞中Id基因的表达是改善血管重构的肺动脉高压药物的新靶点之一[YangJatalAmJ PhysiolLungCellMolPhysiol2013 15:305(4):L312-21]〇
[0004] 骨形成蛋白BMPs是TGFP家族中的一类蛋白，它们在早期发育和分化，包括肺 的器官形成以及血管生成中起着重要作用。在BMP配体包括BMP2,BMP4,BMP6,BMP9和 BMP10存在的情况下，具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的BMPRII，通过一型受体，磷酸化受体 调节Smad蛋白（R-Smad)。在BMP/Smad诱导转录的效应基因中，目前研究最清楚的是DNA 结合蛋白抑制因子家族成员（inhibitorofDNAbindingprotein，Id)。Id蛋白属于螺 旋-环-螺旋（HLH)转录因子，Id蛋白竞争性结合具基本螺旋-环-螺旋结构的转录因 子（bHLH)而抑制其转录活性，Id在细胞生长、衰老及分化中均发挥作用。实验结果明显提 示BMPR-II受体以及其下游Id基因表达下降在肺动脉高压发生中起主导作用。提高BMP 配体浓度是一种有效的提高下游Id表达水平的方法。BMP2表达上调剂初筛模型-即包含 小鼠bmp2启动子和荧光素酶报告基因的报告质粒稳定转染得到的小鼠颅骨细胞MC3T3-E1 是第一发明人2002年首次在国内建立的，并在抗骨质疏松药物或其先导化合物的发现中 应用至今。经过十余年的BMP2上调剂药物筛选工作，得到了包括2-乙酰苯并噻吩及其类 似物，并开展了抗骨质疏松活性方面的研究。最近BMP信号上调剂也被认为是治疗肺动脉 高压的一个有前景的药革El，EddaSpiekerkoetter等人[EddaSpiekerkoetteratalThe JournalofClinicalInvestigation2013, 123 (8): 3600-3612]通过C2C12-BRE细胞株进 行了对BMP信号上调剂的筛选，发现FK506有较好的改善和逆转肺动脉高压的效果，但由于 其毒副作用未进入临床。C2C12-BRE细胞株是通过将Id的启动子区上的BMP效应元件（BMP ResponsiveElement，BRE)与萤火虫荧光素酶报告基因相连，稳定转染C2C12细胞得到的 [KatagiriTatalGenesCells2002 7:949-960]，通过生物发光检测可检出pm级BMP9 低剂量刺激后引起的荧光素酶活性。本发明首先采用BMP2上调剂模型，发现获得的BMP2 表达上调剂可提高BMP信号并应用于肺动脉高压药物初筛，继而利用具有心血管分化能力 的干细胞系，构建获得特异地改善肺血管重构的Id蛋白表达上调剂药物筛选模型。
[0005] 本发明的创新点之一在于将人胚胎干细胞应用于药物筛选：在过去的药物筛选模 型中经常利用具有无限繁殖能力的肿瘤细胞以满足高通量筛选的需要，但单一肿瘤细胞系 不能对不同疾病类型和患者个体进行针对性药物筛选。这是由于患者细胞不易获得，且培 养代数有限。有一些药物在经过最先进的高通量筛选和严格的临床前分析后，在临床试验 第三阶段失败而不能成药时，造成的损失可能超过10亿美元。之前建立的BMP2上调剂药 物筛选平台基于鼠骨肉瘤细胞系进行的，还存在与人类细胞有种属差异这一缺陷。将人胚 胎干细胞应用于药物筛选的优势在于1.干细胞的无限增殖能力，符合高通量药物筛选； 2.基于其多功能潜性，可以分化形成相关的细胞类型。3.诱导多功能干细胞技术可以根据 病人个体差异'定身量衣'，打破单一细胞系缺乏有效模拟生物个体差异的局限，避免漏筛 和错筛[WillardVPatalArthritisRheumatol. 2014, 66 (11) : 3062-72]。因此用一种可 以来自任何个体的细胞代替肿瘤细胞是一种有益的选择。
[0006] 人胚胎干细胞具有肿瘤细胞没有的优势，但该细胞是否能够成功用于抗肺动脉高 压药物筛选，目前没有报道。本发明人将人胚胎干细胞应用于抗肺动脉高压药物的筛选，意 外的发现测定结果灵敏，稳定，简单，具有现有技术无法比拟的优势。
[0007] 所以在通过对遗传性和特发性肺动脉高压致病关键信号通路进行透彻研究后，我 们以BMP信号下游关键基因Idl基因为靶点，设计双报告基因原件插入Idl基因组构建重 组载体，并转入人胚胎干细胞株，获得稳定表达的细胞株，以此建立以荧光素酶表达量作为 指标，获得对Idl表达上调的治疗肺动脉高压的化合物筛选模型。对候选化合物进行了测 试，达到了理想的技术效果。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是建立一种用于筛选肺动脉高压治疗药物的干细胞模型，发现新型 的提高BMP信号的肺动脉高压治疗药物先导化合物。
[0009] 为此，本发明提供一种保藏编号为CGMCC11091的细胞株。所述细胞命名为为 ID1-V-LUChES，保藏于：中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC)，地址：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCCNo. 11091。
[0010] 本发明提供一种筛选抗肺动脉高压的化合物的模型，所述模型特征在于：
[0011] 以BMP信号下游关键基因Idl基因为靶点，设计双报告基因原件插入Idl基因组 构建重组载体，并转入人胚胎干细胞株，获得稳定表达的CGMCC11091的细胞株，将待测抗 肺动脉高压的化合物刺激CGMCC11091的细胞株，再用细胞裂解液裂解细胞，按基因检测系 统所述方法检测荧光素酶表达活性，以Idl启动子驱动的双报告基因表达量作为指标，获 得对Idl表达上调的治疗肺动脉高压化合物的筛选模型。
[0012] 本发明进一步提供构建模型的方法，步骤如下：
[0013] (1)从数据库中找到Idl基因的基因组序列，确定打靶位点为其外显子1，检索包 含Idl基因完整序列的BAC质粒（5'和3'上下游5Kb序列）。
[0014] (2)生物信息学分析：利用A0S电脑程序，设计并选择最优的位于Idl基因1号外 显子ATG下游231bp的U5和D3位点，用于重组打靶。
[0015] (3)PCR反应产生基因特异性重组片段：
[0016] 用于扩增重组片段的引物是由通用引物序列和Idl基因序列共同组成，电转将抗 性筛选框插入已诱导重组酶活性的BAC质粒中，获得带筛选框的BAC-Idl质粒。
[0017] (4)中间载体的构建：
[0018] 将一个基于PsclOl质粒框架、四环素（Tet)诱导重组的质粒PsclOlgbaA，转化至 携带含Idl基因BAC质粒（BAC-Idl)的E.Coli克隆中；通过第一次同源重组将带有gateway R1/R2位点和细菌正（zeocin)负（pheS)筛选标记的DNA片段插入到BAC-Idl质粒U5/D3 位点中；第二次同源重组将带有R3和R4两个gateway位点的pBR322质粒片断与BAC-Idl 进行gap-repair反应，获得中间载体。
[0019] (5)目的重组载体的构建：
[0020] 目的载体的构建基于Gateway系统的三个质粒：本发明构建的中间载体和含有靶 向元件的pLlL2_BacT质粒以及含负筛选标记的pL3L4_DTA质粒组成。经两次gateway的 转换体系，最终产生高拷贝的目的重组载体Idl-Venus-Luc-MCl-DTA。
[0021] (6)筛选细胞株的获得
[0022] 将Idl-Venus-Luc-MCl-DTA质粒用AsiSI线性化处理，电转P57代人胚胎干 细胞即，获得整合型Idl启动子驱动Venus-Luci双报告基因表达的人胚胎干细胞株， 得到CGMCC11091的细胞株，进行早期中胚层分化，将待测抗肺动脉高压的化合物刺激 CGMCC11091的细胞株，再用细胞裂解液裂解细胞，按基因检测系统所述方法检测荧光素酶 表达活性，以Idl启动子驱动的双报告基因表达量作为指标，获得对Idl表达上调的治疗肺 动脉高压化合物的筛选模型。
[0023] 本发明还包括用本发明的模型筛选后得到的化合物在制备抗肺动脉高压的药物 中的应用，所述化合物选自：
[0024] 哌啶基-嘌呤类衍生物：1H-吡唑[3, 4-d]嘧啶，1-苯-4-(1_哌啶 基）-lH-Pyrazolo[3, 4_d]pyrimidine,l-phenyl_4-(l-piperidinyl)-(Cas No:23000-46-6)，
[0025]2_ 乙醜苯并噻吩2_Acetyldibenzophen(CasNo:2272〇-75-8)，
[0026] 芒柄花