可抑制埃博拉病毒基因复制的活性分子及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及治疗埃博拉病毒的siRNA抑制剂、其纳米颗粒载体以及药物的配置和 方法。
【背景技术】
[0002] 1、埃博拉病毒感染疾病
[0003] 埃博拉病毒感染疾病（简称埃博拉病，EVD)是发生于人类和灵长类动物中的一种 严重的、会致命的疾病，死亡率往往高达50% -90%。自从1976年在刚果和苏丹发现了埃 博拉病毒，迄今为止，共发现了 5种埃博拉病毒亚型：扎伊尔埃博拉病毒（EB0V)、苏丹埃博 拉病毒（SUDV)、塔伊森林埃博拉病毒（TAFV)、雷斯顿埃博拉病毒（RESTV)和本迪布焦埃博 拉病毒（BDBV)。其中，已确定是EBOV、SUDV和BDBV造成了非洲EVD的大爆发。
[0004] 埃博拉病毒是单链的线性负链RNA病毒，属丝状病毒科，其基因组的长度约为 19kb，编码7个结构蛋白核蛋白（NP)、聚合酶辅因子VP35、VP40、糖蛋白（GP)、转录激活因 子VP30、VP24、和RNA聚合酶（L)以及一个非结构蛋白的分泌糖蛋白（sGP)。目前，还没有 用于预防或治疗EDV的批准疫苗或特效疗法，如通过沉默病毒基因表达的疗法。基于此，本 发明提出了一种EDV治疗方法来满足这种需要。
[0005] 埃博拉病毒似乎在各种类型的感染的成纤维细胞（fibroblasts，尤其是成纤维网 状细胞）中最活跃。第二个出现埃博拉病毒的最常见的细胞类型是具有树突细胞的单核吞 噬细胞，比单核细胞或巨噬细胞更易感染。内皮细胞周围的结缔组织完全感染后，其自身也 会感染。然后，作为感染最终的结果是任何类型的上皮细胞也会被感染。通常情况下，上皮 细胞只有在接触扩增病毒的其他细胞才会感染，如成纤维网状细胞（FRC)和单核细胞。这 可能适用于皮肤附属物，如毛囊和汗腺，因为这些皮肤附属物都严重血管化，并且具有大量 的FRC。肝细胞和肾上腺上皮细胞具有成纤维细胞网状组织（作为其主要的连接组织）和 常驻的（resident)附于FRC细胞上的单核细胞巨噬细胞（在血液/上皮细胞界面附近）。 埃博拉病毒感染和传播的时间顺序很难推测，因为大多数研究在"尸检"的动物中进行，而 它们往往处在感染的最后阶段。
[0006] 虽然在死亡的时候，身体或器官系统的某些区域可能处在早期感染阶段，但利用 这个信息来推导感染和传播的顺序仍然不是一个好主意。只有通过体内分析实验，即按照 一个时间过程方案对实施安乐死的动物进行连续尸检，才能得知感染和传播的实际顺序。
[0007] 2、目前的预防和治疗措施
[0008] 目前为止，人们对开发EVD的有效治疗方法和疫苗做了很多尝试。以下是WHO在 最近的一个报告中罗列的一些主导项目：
[0009] 恢复期血浆：研究认为，从EVD幸存者身上输血也许可以预防或治疗其他人的埃 博拉病毒感染，但研究的结果仍然难以解释。不知道幸存者血浆中的抗体是否足以治疗或 预防埃博拉病毒病。如果血液由管理良好的血库提供，这种方法应该是安全的。与其他血 液制品的使用所产生的风险相同，该方法可能引起疾病的血源性病原体的传播。关于EVD 感染的抗体依赖性增强存在理论性的担忧，认为抗体有可能反而增加细胞的感染性。输血 是西非文化可以接受的。潜在的献血者是埃博拉幸存者，但是采血后的物流运输是个问题。 在患者中开展研究正处在探索中。首批血浆可能在2014年底获得。
[0010]ZMapp鸡尾酒：这种候选药物由三种嵌合的鼠人单克隆抗体组成（Mapp BiopharmaceuticalInc.)。通过在病毒的表面或"包膜"上结合或涂布不同的位点，这三 种抗体能阻断或中和病毒。猴子中进行的研究表明，存在病毒和/或发热的情况下，其生存 可以长达5天。该疗法在人类中尚未进行正规的安全性研究。极少数EVD感染者被给予了 ZMapp，并且至今还没有报道过安全问题。临床疗效还不确切。非常有限的供应量（不超过 10个疗程）被部署到了这一领域。如果努力扩大产量，有望在2014年底增加几百个剂量。
[0011] 高免疫球蛋白：这种候选药物通过纯化和浓缩血浆制备，血浆来自免疫动物或之 前感染过埃博拉病毒且对EVD具有高滴度中和抗体的人群。能够中和不同EVD病毒株的抗 体已被生产出来，并且显示在猴子中（当暴露于EVD48小时后开始使用抗体治疗）具有保 护作用。通常情况下，抗体是安全的。使用高免疫球蛋白治疗人类的其他感染原具有丰富 的经验。灭火和纯化过程有效的消除了致病的血源性病原体。目前，这种候选药物还没获 得，因为需要几个月来免疫动物、收集血浆和制备纯化产品。在马身上生产免疫球蛋白的工 作已经开始展开，并且在牛身上生产人免疫球蛋白的工作也已开始。在马身上进行的研究 在6个月内进行，但是，大批量的用于人类可能要等到2015年年中以后。
[0012] TKM-100802 :这个候选药物是一个脂质纳米颗粒小干扰核糖核酸（siRNA) (Tekmira)，靶向两个重要的病毒基因以阻止病毒复制。该药物在豚鼠和猴子中被证明有 效。在猴子中，感染48小时后给药存活率是83%，感染72小时后给药存活率是67%。健 康受试者中进行的单剂量研究发现有头痛、头晕、胸闷和高剂量下提高心率的副作用。在较 低剂量下，药物具有更好的耐受性。美国食品药品监督管理局已经批准EVD感染者在紧急 情况下可以使用此种药物，可能可以获得数量有限的疗程。到2015年早期，可能可以生产 出900个疗程。
[0013]AVI7537 :这个候选药物是基于寡聚核苷酸（磷酰，Sar印ta)。在猴子中进行的研 究中，感染时连续给予14-40mg/kg的剂量，连续给药14天，幸存率为60-80 %。人类耐受性 早期研究中已得到验证。到10月中旬可以获得20-25个疗程的活性药物中间体。到2015 年初，可能可以达到100个疗程的产量。
[0014]Favipivavir/T-705 :这个候选药物（(ToyamaChemical/FujiFilm)已经被证明 对小鼠EVD有效，但是在猴子实验中，只有1/6存活了下来。另一项采用不同剂量方案的动 物实验正在进行。日本已经批准这种药物用于特殊情况下的流感治疗，但在其他国家仍处 在研究中，其测试人数超过1000人，且没有产生严重不良影响。但是治疗EVD的建议剂量 可能是目前测试剂量的2-5倍，并且治疗的持续时间可能会比目前的流感研究更长。怀孕 期间不应使用此药，因为可能会引起先天缺陷。此药还没有用于人体埃博拉的研究。实地 接触后（fieldpost-exposure)的预防使用正处在讨论阶段。虽然可获得超过10000个疗 程，但是治疗EVD的剂量有待确定。
[0015] 80乂4430:这个抗病毒药物在￡￥0啮齿动物中进行的研究可获得83%-100%的存 活率，在感染致命性Marburg病毒48小时后用药也有效，Marburg病毒和埃博拉病毒属于同 一家族。该药用于猴子EVD治疗的研究正在进行，但是还没有人体安全性研究或数据。在 考虑安全性研究之前，需要该药用于EVD的动物治疗和保护数据。
[0016] 干扰素：这种商业化的产品可诱导暴露细胞的抗病毒状态，并调节免疫系统。一项 研究表明，干扰素能推迟猴子的死亡时间，但是总体上不会提高EVD患者的存活率。早期给 药能提高动物治疗的有效性，并延长病毒感染时间，在这期间抗体发挥作用。批准用于治疗 慢性肝炎和多发性硬化症的有多种干扰素剂型。高剂量往往会增加不良反应，且无法获得 更好的疗效。市面上有几种类型的干扰素。用哪个干扰素、什么时候用和剂量方案都需要 慎重考虑。
[0017] 3、处在开发阶段的疫苗
[0018] 在动物身上已经测试了很多候选EVD疫苗，但是大多数不能制备成适合人类使用 的剂型。有两个候选疫苗比较有希望用于人类，且已经过动物测试，准备在早期的人体临 床试验中进行测试，以确定它们是否安全和诱导免疫反应。给实验室工作人员接种其中的 一种疫苗，在其暴露于EVD之后的若干年前接种。两种疫苗都是重组的，意味着不同的病毒 (认为对人体是安全的）会引起接种个体EVD的部分表达，这是为了激发针对埃博拉病毒的 免疫反应而没有自身引起疾病对的风险。目的是诱导有效的免疫应答并保护后续感染。在 第一个人体试验中，会在少数志愿者中确定安全性和免疫反应。
[0019] 黑猩猩腺病毒3型（ChAd3)疫苗：这种疫苗采用黑猩猩不生长的腺病毒，包含编码 EVD表面蛋白的基因。在一项给予EVD致死剂量的动物研究中，所有16只动物都受到了单 剂量疫苗的保护。超过1300人接种了这些疫苗用于预防其他疾病，其中在闪比亚、塞内加 尔、布基纳法索和肯尼亚的接种人数就超过1000人。目前为止，这些疫苗似乎是安全的，但 是尚未有人类接种EVD疫苗的安全信息，也还没有人体试验的相关信息。EVD疫苗的一个早 期试验包含两个EVD病毒株，扎伊尔埃博拉病毒（EB0V)和苏丹埃博拉病毒（SUDV)，预计在 2014年9月展开。一个预防扎伊尔EVD的疫苗可能会在英国试验，然后会于2014年在一两 个非洲国家进行试验。何时可使用这些疫苗取决于试验的结果和生产时间表。到2014年 底可能可以获得大约1500个剂量。
[0020] 重组水泡性口膜炎病毒（rVSV)疫苗：rVSV疫苗旨在诱导EVD特异性的免疫应答。 该疫苗保护了所有给予EVD致死剂量的20只动物。rVSV-EVD不会损害免疫力下降的动物。 当直接注射至动物大脑时，该疫苗是安全的。目前还不清楚rVSV-EVD是否会在人体中增 长，尤其是免疫力下降的人群。rVSV-EVD增长乏力会降低疫苗的作用，增长的过多又会引 起疾病。将rVSV-EVD引入未接种疫苗的人体或动物中的后果是未知的。一个实验室工作 人员被针刺伤后接种了rVSV，状态良好。但这并不能证明该疫苗就是安全的或具有保护作 用。该工作人员注射rVSV-EV疫苗后，短时内在血浆中检测到了少量的疫苗。相关的安全 性、有效性和保护作用的持续时间不得而知。一项早期试验即将在美国展开。目前可获得 800个剂量。
[0021] 4、siRNA :-个灵活的（flexible)EVD分子平台
[0022] 埃博拉病毒是一种高致病性的病原体，会引起严重的出血热，在人类和非人类灵 长类动物中（NHP)具有高病死率。虽然目前还没有安全有效的疫苗或其他药用制剂来阻 断埃博拉病毒感染，但是为了寻找治疗和预防埃博拉出血热的有效候选药物，已经做出 了巨大努力。最近，美国食品药品监督管理局（FDA)已经批准了研究性新药（IND) siRNA 的申请，并且两种小分子疗法已经进入了I期临床试验，包括反义磷酰吗啉寡聚物（PM0: AVI-6002,AVI-6003)和脂质纳米颗粒 / 小干扰RNA(LNP/siRNA:TKM-Ebola)。
[0023]RNA干扰（RNAi)天然存在，是特定的基因调控模式。RNAi机制既精细又具有高识 别性的（SiomiandSiomi2009)。起初，短（19-25bp)双链RNA序列（称为短干扰RNA， siRNA)和胞浆中的RNA干扰沉默复合物（RISC)(Jineketal. 2009)结合在一起。之后，所 产生的的复合物跟信使RNA(mRNA)的互补序列结合，最终降解（和/或较少转录）这些转 录子。科学家已经利用内源性RNAi机制来推动广泛的基础研究。因为siRNA可以靶向几 乎任何基因，并且可以通过各种方法导入细胞，所以RNAi是一个相当灵活的平台，通过这 个平台，研究人员和临床医生能够控制包括病毒感染在内的各种疾病。
[0024]RNAi技术已经用于广泛的人类致病病毒，包括埃博拉病毒（GeisbertTW,et al. 2006and2010；SpurgersKBetal, 2010；MateoMetal.2011；FabozziG,et al. 2011;ZhuY,etal. 2012)，而Geisbert和其同事对siRNA治疗EVD的应用开发处在最 前沿。美国FDA已经批准siRNA在西非的紧急使用。Geisbert和其同事的研究最初使用四 种靶向EB0V扎伊尔亚型（ZEB0V)聚合酶（L)基因的siRNA，这些siRNA跟聚乙烯亚胺（PEI) 混合使用或制成稳定的核酸-脂质颗粒（SNALPs)使用。豚鼠在感染ZEB0V之前和之后用 这些siRNA治疗。用PEI多聚物导入L基因特异性的一组siRNA来治疗豚鼠，在感染ZEB0V 前不久给药的话，会引起血浆病毒血症水平降低并部分的保护动物免于死亡。用SNALPs导 入相同siRNA的试验表明这个导入系统更有效，因为在感染ZEB0V前不久给药的话，它能完 全保护豚鼠免于病毒血症和死亡。进一步的研究表明，4个siRNA中只有1个能完全保护豚 鼠免于致命性ZEB0V的威胁。这项技术已经在非人类灵长类动物中进一步开发。
[0025] 该技术利用修饰的非免疫刺激性siRNA和ZEB0V出血热模型中致命性一致的非 人类灵长类动物模型，在SNALPs中制备成了修饰性siRNA组合物，靶向ZEBOVL聚合酶 (EK-lmod)、病毒蛋白（VP)24(VP24-1160mod)和VP35(VP35-885mod)。一组猕猴（n= 3)在 暴露于ZEB0V(用ZEB0V病毒感染）后30分钟、第1天、第3天和第5天分别给予抗ZEB0V siRNA治疗。第2组猕猴（n= 4)在暴露于ZEB0V后30分钟、第1天、第2天、第3天、第4 天、第5天和第6天分别给予抗ZEBOVsiRNA治疗。感染ZEB0V后给予四次抗ZEBOVsiRNA 治疗的猕猴，有2/3(66% )受到了保护，避免了死亡；而感染ZEBOV后给予七次抗ZEBOV siRNA治疗的猕猴，全部避免了死亡。第二个研究的治疗方案耐受性良好，肝酶有微小变化， 这可能与病毒感染有关。这个暴露于ZEB0V之后对非人类灵长类动物产生的保护作用为治 疗ZEB0V出血热提供了一个模型。这些数据表明RNA干扰有望成为一种有效的暴露后治疗 策略，用于感染埃博拉病毒的患者，此外，这个治疗策略也许还可以治疗其他新出现的病毒 感染（GeisbertTW,etal. 2010and2014) 〇
[0026]RNAi的作用包括：1)有效抑制病毒复制而不依赖宿主的免疫功能；和2)同时靶 向多个基因和/或序列，对基因组迅速变异的病原体（如EVD)是个理想的治疗方法。尤其 是，siRNA疗法可能使特定的患者群体受益，如对疫苗不能产生强烈免疫反应和不能完全受 疫苗保护的婴幼儿或老年人。