用于肝癌预后评估的微小核酸序列、探针以及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肝癌检测领域，具体而言，涉及用于肝癌预后评估的微小核酸序列、探 针以及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 原发性肝癌是世界第五大常见恶性肿瘤，超过90%的原发性肝癌是肝细胞性肝癌 (HepatocellularCarcinomas,HCCs，简称肝癌）。我国是肝癌高发地区，其死亡率在恶性肿 瘤中上升至第二位。但是，HCC患者就诊时往往已是晚期，出现包括远处转移或肝内转移等 并发症，手术的根治性切除率很低，预后通常很差，而转移复发也一直是影响肝癌治疗效果 的重要因素。肝癌的转移是一个涉及许多调控因素的复杂过程。目前已知有肝癌及间质细 胞遗传学与表面遗传学的改变引起的基因、细胞表面结构和粘附能力、局部血管生成能力、 细胞代谢功能以及癌细胞与宿主、癌细胞与细胞间质之间相互作用等过程的改变参与肝癌 的转移。
[0003] 肿瘤侵袭和转移过程中癌细胞和癌旁基质之间的相互调节作为一个动态系统已 被广泛研究。由于肝细胞癌引起死亡的主要原因是肿瘤的进展和转移，因此深入研究肿瘤 转移过程中重要的节点分子将有助于系统性阐述肝癌转移的分子机理。微小核酸分子的发 现描述了一种全新的基因活动形式，即转录后翻译水平的修饰。大量互相影响并且在幕后 控制分子的微小核酸分子参与了这种活动。近年来，有大量关于促转移和抑制转移基因、微 小核酸分子和细胞代谢在肝癌转移中作用机制的研究，在一定程度上揭示了肝癌的转移复 发的调控机制。但是对于肝细胞癌的基础研究和临床治疗而言，一个必须重视的命题是对 肝细胞癌的预后影响因素进行深入研究。
[0004] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一目的在于提供一种用于肝癌预后评估的微小核酸序列，所述的微小 核酸序列在肝癌中高表达，除了可影响肝癌干细胞的生长，化疗抵抗及自我更新能力之外， 还可以通过靶向抑制其他分子调节肝癌细胞的转移侵袭能力。通过对这些肝癌特异性的微 小核酸进行检测，可预测肝细胞癌手术后复发、转移等事件，并判断预后，对于肝细胞癌病 人术后监控和序贯治疗具有非常重要的指导意义。
[0006] 本发明的第二目的在于提供一种探针，该探针根据SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 12 所示核酸序列制得，利用该探针通过原位杂交的方法检测微小核酸序列，灵敏度高，特异性 强。
[0007] 本发明的第三目的在于提供一种试剂盒，该试剂盒含有上述探针，该试剂盒针对 这些肝癌特异性的微小核酸进行检测，可预测肝细胞癌手术后复发、转移等事件，并判断预 后，对于肝细胞癌病人术后监控和治疗具有非常重要的指导意义。
[0008] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0009] 一种用于肝癌预后评估的微小核酸序列，包括SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 12核酸序 列中的任一种或多种。
[0010]SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 12 核酸序列具体如下：
[0011]SEQNo. 1 ：5, -UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU-3,
[0012] SEQNo. 2 :5' -TAATACTGTCTGGTAAAACCGT-3'
[0013]SEQNo. 3 :5' -ACGGUUUUACCAGACAGUAUUA-3'
[0014]SEQNo. 4 :5' -ACGGTTTTACCAGACAGTATTA-3'
[0015]SEQNo. 5 :5' -UGAGGUUGGUGUACUGUGUGUGA-3，
[0016]SEQNo. 6 :5' -TGAGGTTGGTGTACTGTGTGTGA-3'
[0017] SEQNo. 7 :5, -UCACACACAGUACACCAACCUCA-3'
[0018]SEQNo. 8 :5, -TCACACACAGTACACCAACCTCA-3'
[0019]SEQNo. 9 :5' -CUGCGCAAGCUACUGCCUUGCU-3'
[0020] SEQNo. 10 :5' -CTGCGCAAGCTACTGCCTTGCT-3'
[0021] SEQNo. 11 :5' -AGCAAGGCAGUAGCUUGCGCAG-3'
[0022] SEQNo. 12 :5, -AGCAAGGCAGTAGCTTGCGCAG-3,。
[0023] 本发明通过收集临床肝癌病人门静脉癌栓/肝癌原发灶/癌旁正常肝组织新鲜冰 冻配对样本，利用实时定量PCR对门静脉癌栓/肝癌原发灶/癌旁正常肝组织样本中特异 微小核酸分子的表达水平进行验证，再利用锁核酸（LNA)探针-原位杂交技术，检测特异微 小核酸分子在门静脉癌栓/肝癌原发灶/癌旁正常肝组织样本的表达丰度。结果发现特 异微小核酸分子在门静脉癌栓中高表达，且在肝癌原发灶及癌旁正常组织中的表达逐渐降 低，并可以通过靶向抑制其他分子调节肝癌细胞的转移侵袭能力，表明特异微小核酸分子 表达水平可作为肝癌转移复发的潜在预测指标。
[0024] 经验证，对SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 4核酸序列中的任一种进行检测，可用于肝癌 预后评估，特异性好，反应灵敏，可靠性更高。优选地，包括SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 4核酸 序列中的任一种。
[0025] 更优选地，包括SEQIDNo.1核酸序列。
[0026] 本发明还提供了根据上述微小核酸序列制备的探针。
[0027] 该探针根据SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 12所示核酸序列制得，利用该探针通过原位 杂交的方法检测微小核酸序列，灵敏度高，特异性强。
[0028] 优选地，所述探针与SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 12所示核酸序列和/或其互补序列 的全部或连续15个以上核苷酸片段互补。即可达到检测的特异性和灵敏度的要求。
[0029] 微小核酸分子的特异性探针，为可任意能够特异性与特异微小核酸分子结合的脱 氧/核糖核酸探针，或经过修饰、标记的核酸片段。进一步地，所述探针为脱氧核糖核酸探 针或核糖核酸探针。
[0030] 进一步地，所述探针包括锁核酸探针、荧光探针、地高辛标记探针、生物素标记探 针中的任一种。以这些标记物制备的探针，得到的检测信号便于区分。
[0031] 本发明还提供了一种用于肝癌预后评估的试剂盒，包括上述的探针。
[0032] 该试剂盒含有根据SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 12所示核酸序列制备的探针，将特 异微小核酸分子作为分子标记，利用特异微小核酸分子的特异性探针，结合原位杂交探针 试剂，检测特异微小核酸分子在肝癌组织中的表达量，预测肝细胞癌手术后复发、转移等事 件，并判断预后，对于肝细胞癌病人术后监控和治疗具有非常重要的指导意义。
[0033] 为了便于检测，优选地，所述试剂盒还包括原位杂交试剂。
[0034] 根据原位杂交的需要，可选择原位杂交试剂。进一步地，所述原位杂交试剂包括但 并不限于以下这些试剂：二甲苯、乙醇、DEPC水、PBS、蛋白酶K、甘氨酸、PBS、多聚甲醛、杂交 液、清洗液、封闭液、平衡液、显色剂。
[0035] 采用微小核酸序列能够进行肝癌预后评估，步骤如下：
[0036] 制备待检测样本的组织芯片；
[0037] 将所述组织芯片进行原位杂交，所述原位杂交采用的探针为本发明提供的根据 SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 12所示核酸序列制备；
[0038] 根据原位杂交后的组织芯片的信号强度进行判断。
[0039] 为了使检测的样本可靠性更高，进一步地，所述组织芯片由组织芯片制作仪制备， 所述组织芯片的厚度为3-5ym。
[0040] 利用组织芯片制作仪依次从供体蜡块上穿取直径为1mm的组织芯，插入有240个 点阵的受体蜡块中，以3-5ym的厚度连续切片即得。
[0041] 通过对供体组织的多个位点测定，以增加准确性。
[0042] 进一步地，所述组织芯片的信号强度通过生物图像处理软件分析得到。通过生物 图像处理软件对得到的信号强度进行分析，方便快捷，并减少人为操作的误差。
[0043] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0044] (1)本发明提供了一种用于肝癌预后评估的微小核酸序列，所述的微小核酸序列 在肝癌中高表达，除了可影响肝癌干细胞的生长，化疗抵抗及自我更新能力之外，还可以通 过靶向抑制其他分子调节肝癌细胞的转移侵袭能力。通过对这些肝癌特异性的微小核酸进 行检测，可预测肝细胞癌手术后复发、转移等事件，并判断预后，对于肝细胞癌病人术后监 控和序贯治疗具有非常重要的指导意义。
[0045] (2)本发明还提供了一种探针，该探针根据SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 12所示核酸 序列制得，利用该探针通过原位杂交的方法检测微小核酸序列，灵敏度高，特异性强。
[0046] (3)本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒含有根据SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 12 所示核酸序列制备的探针，通过探针对这些肝癌特异性的微小核酸进行检测，可预测肝细 胞癌手术后复发、转移等事件，并判断预后，对于肝细胞癌病人术后监控和治疗具有非常重 要的指导意义。
【附图说明】
[0047] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0048]图1为本发明实施例1中不同肝组织样本中的特异微小核酸分子表达水平图；
[0049]图2为本发明实施例2中基于肝癌病人组织芯片的锁核酸原位杂交实验制备的石 蜡切片样本中特异微小核酸分子染色强度评分标准示意图；
[0050] 图3为本发明实施例2中对207例肝癌病人的组织芯片进行预后评估的生存期曲 线图。
【具体实施方式】
[0051] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市售获得的常规产品。
[0052] 实施例1
[0053] 特异微小核酸分子在肝癌门静脉癌栓中的表达
[0054] 1.临床组织样本的选取：
[0055] 临床组织样本来源于上海某医院，以上样本均获得本人的知情同意，获取18例肝 癌组织样本及其配对门静脉癌栓，癌旁正常肝组织。
[0056] 2.特异微小核酸分子在肝癌门静脉癌栓中表达异常：
[0057] 对18例HCC病人的门静脉癌栓（PVTT)/原发灶/癌旁正常肝组织样本中的特异 微小核酸分子（SEQIDNo. 1-SEQIDNo.4)表达水平进行的定量PCR检测。
[0058] 具体为：将各个待检测样本分别提取RNA，然后反转录成cDNA，用探针进行定量 PCR检测。
[0059] 其中，定量PCR检测所使用的反转