亚洲玉米螟吐丝基因片段及其克隆方法和应用

文档序号:9344257阅读:533来源:国知局
亚洲玉米螟吐丝基因片段及其克隆方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域,涉及昆虫丝腺泌丝因子的一种基因序列、氨基酸序列, 具体涉及亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)丝素轻链蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序 列,并涉及该基因的用途。
【背景技术】
[0002] 亚洲玉米螟属鳞翅目,螟蛾科,杆野螟属,又称为玉米钻心虫。亚洲玉米螟是一种 多食性害虫,在中国、东南亚、澳大利亚、印度、朝鲜等地区广泛分布。亚洲玉米螟食性非常 广泛,寄主范围广,除玉米、高粱、谷子外,还有小麦、棉花、水稻等多达69种。亚洲玉米螟低 龄幼虫会在玉米心叶中取食,致使玉米心叶不能展开,同时低龄幼虫可以吐丝下垂,借助风 力转移为害;高龄幼虫会在茎杆及穗部钻蛀,使植株得不到足够的养分而使生长发育受阻, 导致玉米、棉花等籽粒干瘪、灌浆不足,继而造成产量下降。有研究表明,亚洲玉米螟给世界 粮食生产都造成了严重的经济损失,在中国亚洲玉米螟造成玉米减产十分严重,虫害发生 严重的年份损失达到30%。近年来亚洲玉米螟的发生规律随着气候条件的改变也发生了变 化,发生频率更是逐渐上升,鉴于此,我国每年都会耗费巨大的人力、物力对该虫进行防治, 但效果却一直不理想。
[0003] 本专利从亚洲玉米螟幼虫吐丝转移和化蛹滞育前吐大量丝的现象着手,寻找亚洲 玉米螟与吐丝相关的基因,并利用RNAi技术干扰相关基因的表达乃至沉默,从而达到减轻 亚洲玉米螟为害的目的。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于提供了一种亚洲玉米螟吐丝基因片段及其克隆方法和应用,本 发明采用同源基因克隆策略和PCR技术,扩增中间片段,再根据测序结果,设计3'和5'引 物,使用RACE法,分别扩增出3'和5'区段,测定序列后拼接成完整的基因序列,再使用0RF Finder分析得到亚洲玉米螟丝素蛋白基因轻链基因部分的开放阅读框。
[0005] 本发明的第一个目的是通过以下技术方案实现的,亚洲玉米螟吐丝基因片段,序 列如SEQ ID N0. 12所示。
[0006] 本发明的第二个目的是通过以下技术方案实现的,亚洲玉米螟吐丝基因片段的克 隆方法,采用同源基因克隆策略和PCR技术,扩增中间片段,再根据测序结果,设计3'和5' 引物,使用RACE法,分别扩增出3'和5'区段,测定序列后拼接成完整的基因序列。
[0007] 优选地,所述克隆方法包括以下步骤:
[0008] (1)亚洲玉米螟幼虫总RNA的提取;
[0009](2) cDNA第一条链的合成;
[0010] ⑶亚洲玉米螟丝素轻链基因中间片段扩增;
[0011] (4)丝素轻链基因的3 ' Race;
[0012] (5)丝素轻链基因的5 ' Race ;
[0013] (6)对所得的中间片段、3' RACE片段及5' RACE片段进行拼接,得到亚洲玉米螟丝 素轻链基因的cDNA全长序列。
[0014] 优选地,所述亚洲玉米螟幼虫总RNA的提取参照Promega公司的SV Total Isolation System 试剂盒。
[0015] 优选地,所述cDNA第一条链的合成步骤为:
[0016] (1)先在微型塑料离心管Microtube中按照以下比例配制10 y L的反应体系:
[0017]
[0018] (2) 65°C保温5min后置于冰上急冷;
[0019] (3)在步骤⑵得到的反应液的体系中继续按以下比例配制反应体系:
[0020]
[0021] (4)缓慢混勾,进行反转录反应,反转录反应条件:42°C 60min ;70°C 15min ;
[0022] (5)反应结束,将样品在冰上迅速冷却,得到cDNA。
[0023] 优选地,所述亚洲玉米螟丝素轻链基因中间片段扩增步骤包括:
[0024] 第一,引物设计与合成
[0025] 引物序列为:
[0026] Fib-F :5'-ATGCTGCCCTTCGTTTTG-3' ;
[0027] Fib-R :5'-CCCAAGCTGCTTCGAATT-3' ;
[0028] 第二,丝素轻链基因中间片段的扩增
[0029] 第三,目的基因片段产物的回收与纯化
[0030]米用TaKaRa公司的Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver. 2. 0试剂盒, 用于凝胶回收;
[0031]第四,目的基因产物的连接与转化
[0032] 第五,单菌落PCR检测。
[0033] 优选地,所述丝素轻链基因的3' Race包括以下步骤:
[0034] 第一,反应原理与引物设计
[0035] 1) 3 '端的获得是通过TAKARA公司的3 '-Fu11 RACE试剂盒所获得;
[0036] 2)3'race引物设计与合成:
[0037] 设计了 4条3'端特异性引物,分别为
[0038] 3g :5'-TCGCTCCAGTTGCTGACAATG-3';
[0039] 3b :5'-GCGACACCAACATCTACATCCT-3' ;
[0040] 3c :5'-ATCATCAACGACCTGTCCAACC-3' ;
[0041] 3e :5'-GTTCAGGCAACAACTCTGGTCTC-3';
[0042]第二,3' RACE 的扩增
[0043] (1)以所述提取的亚洲玉米螟总RNA为模版,再通过TAKARA公司的3'-Ful1 RACE 试剂盒内的3' RACE Adaptor引物进行反转录,由此获得1st Strand cDNA,
[0044](2)使用3'RACE设计的特异性outer引物与TAKARA公司的3'-Full RACE试剂 盒内的 3'RACE outer Primer进行outer PCR反应,
[0045] (3)再以outer PCR产物为模版,分别使用3'RACE设计的特异性inner引物与 TAKARA公司的3'-Full RACE试剂盒内提供的3'RACE inner Primer进行inner反应,
[0046](4)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,扩增出分别长约900bp、 700bp的特异条带;扩增产物的胶回收、克隆测序,测序结果显示该目的片段分别为896bp、 710bp〇
[0047] 优选地,所述丝素轻链基因的5' Race包括以下步骤:
[0048] 第一,反应原理与引物设计
[0049] (1) 5 '端的获得是通过TAKARA公司的5 '-Fu11 RACE试剂盒所获得;
[0050] (2) 5'race引物设计与合成:
[0051] 设计了 3条5'端特异性引物,分别为
[0052] 5e :5'-GGTTGGACAGGTCGTTGATG-3';
[0053] 5c :5'-CTGCTGGATGGTCAGGATGTA-3';
[0054] 5f :5'-CCATTGTCAGCAACTGGAGC-3';
[0055]第二,5'RACE 的扩增
[0056] (1)去除总RNA中裸露的5'磷酸基团
[0057] (2)去除mRNA的5'帽子结构,保留一个磷酸基团
[0058] (3) 5' RACE Adaptor 的连接
[0059] ⑷反转录
[0060] (5)使用5' RACE试验设计的特异性引物与TAKARA公司的5'-FullRACE试剂盒 内提供的引物进行反应:
[0061] (6)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,扩增出分别长约250bp、 170bp的特异条带;扩增产物的胶回收、克隆测序,测序结果显示该目的片段分别为236bp、 148bp〇
[0062] 本发明的第三个目的是,亚洲玉米螟吐丝基因片段在调控亚洲玉米螟的吐丝卷叶 与钻駐为害中的应用。
[0063] 本发明的第四个目的是,亚洲玉米螟吐丝基因片段导入靶标作物中,成为转基因 素材。
[0064] 与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:采用RACE技术克隆出了亚洲玉米 螟丝素轻链基因的cDNA全长。该基因全长1098bp,自39bp至830bp为其开放阅读框,起 始密码子ATG,终止密码子TAA,一共编码263个氨基酸,相对分子量为92. 756kDa,等电点 pi为4. 99。通过同源性比对,亚洲玉米螟丝素轻链基因与棉大卷叶螟(Sylepta derogata Fabricius)同源性为75%,与外米缀蛾(Corcyra cephalonica)的同源性为69%;与大錯 螟(Galleria mellonella)的同源性为68%。该基因片段对亚洲玉米螟的吐丝有重大影 响,它的成功克隆及基因序列的测定为今后进一步研究与控制亚洲玉米螟的吐丝卷叶与钻 蛀为害等奠定了重要基础。
【附图说明】
[0065] 图1 PCR扩增结果;
[0066] 图2胶回收的结果;
[0067]图 3 菌液 PCR 结果(注:M 为 DL2000marker);
[0068]图 4 3' RACE PCR 扩增结果;
[0069] 图5 3' RACE胶回收结果;
[0070]图 6 3' RACE 菌液 PCR 结果(M 为 DL2000marker);
[0071]图 7 5' RACE PCR 扩增结果;
[0072] 图8 5' RACE胶回收结果;
[0073]图 9 5' RACE 菌液 PCR 扩增结果(M 为 DL2000marker);
[0074] 图10开放阅读框扩增结果(M为DL2000marker);
[0075] 图11基于轻链基因氨基酸序列的系统进化树;
[0076] 图12目标基因实时定量PCR溶解曲线;
[0077] 图13内参基因实时定量PCR溶解曲线;
[0078] 图14目标基因实时定量PCR标准曲线;
[0079] 图15内参基因实时定量PCR标准曲线;
[0080] 图16不同发育阶段亚洲玉米螟丝素轻链基因的相对表达量;
[0081] 图17不同温度下亚洲玉米螟丝素轻链基因的相对表达量;
[0082] 图18不同寄主条件下亚洲玉米螟丝素轻链基因的相对表达量;
[0083]图 19 目标 PCR 产物(M 为 DL2000marker);
[0084]图 20 pGEM-T easy 载体与 pET-2P-GFP
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