穿心莲香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及植物基因。 技术背景
[0002] 穿心莲（Andrographis paniculata(Burm. f. )Nees)是爵床科一年生草本植物，有 清热解毒、消炎、消肿止痛作用。它原产于印度半岛和斯里兰卡，目前野生资源匮乏，被列为 严禁出口的保护物种。我国引种栽培穿心莲的历史至少有80年，多年来，广西、四川、福建、 海南、广东等多个省份均种植过穿心莲，但种质间遗传多样性很低，种群繁衍和进化缓慢， 种源保护工作值得重视。
[0003] 穿心莲的主要活性成分是穿心莲内酯（andrographolide)，属于二砲类化合物，分 布在穿心莲的茎、叶片和根系培养物中。国内已经利用穿心莲内酯开发出多种消炎抗菌的 中药产品，包括天津天士力制药股份有限公司研制开发的穿心莲内酯滴丸等，在避免滥用 抗生素方面发挥了一定的作用。
[0004] 进行穿心莲内酯生物合成途径的研究，对于保护穿心莲资源，促进相关中药产业 的可持续发展具有重要的意义。GGPP是植物体内穿心莲内酯合成的主要前体，它是在香 叶基香叶基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPS)的作用下， 由法尼基焦磷酸（farnesyl diphosphate，FPP)加上一个异戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP)基团后产生的。从穿心莲中获取香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因，对于 进行穿心莲内酯生物合成途径的调控具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供穿心莲香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因及其编码的蛋白质。
[0006] 本发明所述穿心莲香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因，其具有如SEQ ID NO: 1所述 序列。基因全长cDNA大小为1440bp，包含一个1047bp的完整的开放阅读框（0RF)(见下划 线部分碱基），其5' UTR大小为240bp，3' UTR大小为153bp，编码348个氨基酸。
[0007] SEQ IDN0:1
[0008] ATGGGGGCCCTATATCTATCTTCTCCCCTCGAGCAGAAATAACCAGCCATCAATGGTGGATTTACCGAC TTCCAGTACCTGCAGCCTCTCCGTCCTTGCTCGCTTCTGCAACAAATAAAGGCACACAGCGGCGTAAGTGAGTGAAG GATTTTTTATCATTTACTTTTGTGAATTTTGGAAACTGAATAGGAATTTTGGGGGTTTTGAATTCCGACTGCGATTT GATCTATTCTACCGACAATGAGTGCGGTGGTGAATCCAATTGCGACGTGGTCGCGGTCGATTTCCGGCGGAGGCTTC CGACCGGAGCAATTCAATTTCCTCAAACCCTCGAGGTTTCGCCCTATGTCGATTTCCTCTGCCATAATCGAGGAAAC CGTCGCCACCGGGAAACCGCATGCCTTCGATCTCAAAAAGTACATGCTCAACAAGGCGAGCGCCGTGAACGCCGCCT TGGAGGAGGCGGTCCCCGTCAGAGATCCGGTCACGATACACGAATCGATGAGGTACTCGCTTCTCGCCGGGGGGAAA CGCGTCCGGCCGATGCTCTGCATCGCCGCCTGCGAGCTGGTCGGCGGTGAGCAGGCCGCCGCCCTCCCGGCCGCCTG TGCGGTGGAGATGATTCACACCATGTCGCTGATGCACGACGACCTCCCCTGTATGGACAACGACGACCTGCGAAGGG GGAAACCGACGAACCACAAGGTGTACGGCGAGGACGTCGCCGTCCTCGCCGGCGACGCACTCCTCGCCTTCGCCTTC GAACATTTGGCGACGGCCACTGAGGACGTCCCTACCAACATGGTAGTATCCGCCATTGGTGAGTTGTCAAGGTGCAT TGGTGCAGAGGGATTGGTGGCAGGGCAAGTGGTGGACATATGTTCGGAGGGGATTTCGGAGGTGGGGCTGGAGCTTC TAGAGTTCATCCACCTCCACAAGACGGCGGCGCTGCTGGAAGGTTCAGTGGTGTTGGGCGCCATATTGGGAGGTGCG ACAGAGTCGGAAGTGGAGCGGCTGAGGAAATTCGCGAGGTGCATCGGGCTGCTGTTCCAGGTGGTGGACGACATCCT AGACGTGACCAAGTGCTCGGAGGAGCTGGGGAAGACGGCCGGGAAGGATCTGGTGGCGGACAAGACGACATACCCGA AGCTGATCGGGATTGAGAAGTCGAGAGAATTTGCAGAGCAGCTGAAGAGGGAGGCTAAAGAGCAGCTGGAGGGGTTT GATCCAGGTAAAGCAGCTCCATTGCTGGCCTTGGCTGATTACATTGCTTCTAGGGATAATTGATGCTTTCATTGCAA GTTTAACTCAACTATTTATGCTTATGTTGCTTTTGTATCTGCCCTTCCTTGAAAATTAGAAGAATATGACCTATTAC TTTTTCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTACTCTGCGTTGATACCACTGCTTA
[0009] 该基因对应的蛋白质，其序列如SEQIDN0:2。
[0010] SEQIDNO:2
[0011] MSAVVNPIATWSRSISGGGFRPEQFNFLKPSRFRPMSISSAIIEETVATGKPHAFDLKKYMLNKASAVN AALEEAVPVRDPVTIHESMRYSLLAGGKRVRPMLCIAACELVGGEQAAALPAACAVEMIHTMSLMHDDLPCMDNDDL RRGKPTNHKVYGEDVAVLAGDALLAFAFEHLATATEDVPTNMVVSAIGELSRCIGAEGLVAGQVVDICSEGISEVGL ELLEFIHLHKTAALLEGSVVLGAILGGATESEVERLRKFARCIGLLFQVVDDILDVTKCSEELGKTAGKDLVADKTT YPKLIGIEKSREFAEQLKREAKEQLEGFDPGKAAPLLALADYIASRDNo
[0012] 本发明的有益效果是：提供了穿心莲香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因序列，为后 续设计引物、构建载体和遗传转化研究提供了便利，为今后进一步研究制备香叶基香叶基 焦磷酸合成酶抗体，通过途径调控提高植物中穿心莲内酯合成量，或者利用合成生物学方 法生产穿心莲内酯，促进相关中医药产业的发展奠定了坚实的基础。
【附图说明】
[0013] 图1提取获得的穿心莲总RNA
【具体实施方式】
[0014] 下面结合附图对本发明做进一步说明。
[0015] 实施例1
[0016] 1材料与方法
[0017] 所有引物均由苏州泓迅生物科技有限公司合成，见表1。总RNA提取所用化学试剂 购自生工生物工程（上海）股份有限公司，其他分子生物学试剂购自宝生物工程（大连） 有限公司。PCR产物和阳性单克隆测序由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司进行。穿心 莲种植在江西中医药大学神农园。
[0018] 表 1
[0019]
[0020] 1. 1总RNA提取和反转录
[0021] 首先配制总 RNA提取液，配方为 2% CTAB，5% PVP K25, lOOmM Tris-HCl (pH 8. 0)， 25mM EDTA(pH 8. 0)，2M NaCl，5% 巯基乙醇。将提取液在65°C水浴30min以上。
[0022] 取穿心莲新鲜的茎和叶约0. 5g，加入3ml总RNA提取液，迅速用研钵研磨粉碎， 在65°C水浴lOmin，再加入3ml氯仿：异戊醇（24 : 1)。lOOOOrpm离心10min后，取上清 600 y 1，加入150 y 1 LiCl，4°C过夜。lOOOOrpm离心20min后，弃上清，再离心lmin，吸干上 清。在沉淀中加入超纯水50 y 1，3M NaCl 5 y 1，96%乙醇125 y 1，颠倒混匀，在-70°C沉淀 30min。在4°C温度下lOOOOrpm离心20min后，弃上清，用600iil 70%乙醇洗涤两遍，将沉 淀溶解在30 y 1超纯水中。用1%琼脂糖凝胶电泳检测产物。
[0023] 米用 Roche 逆转录试剂盒（Transcriptor cDNA Synth. Kit 2)获得 cDNA，每个样 品的总体积20 y 1。首先在12 y 1总RNA中加入1 y 1 Anchored-oligo(dT) 18Primer，轻轻 混匀后，在65°C 反应 lOmin;然后再加入4yl Buf