一种抗除草剂草甘膦基因表达结构及其在玉米中的应用

文档序号:9344267阅读:716来源:国知局
一种抗除草剂草甘膦基因表达结构及其在玉米中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属农作物的生物工程育种领域,具体说,涉及一种抗除草剂草甘膦基因表 达结构及其在玉米中的应用,是通过人工合成除草剂草甘膦抗性基因、定向重组到玉米基 因高效表达的插盒中,通过转基因技术获得耐草甘膦特性优异的转基因玉米。
【背景技术】
[0002] 草害是影响作物生长和产量的重要因素。据联合国粮农组织(FA0)统计,全世界 每年因病虫草害致农作物产量下降三分之一,其中因草害损失11%。要满足日益增长的需 求,粮食生产的集约化和提高单位面积上的生产力是首选措施,而这需要加强草害的防治。 针对草害,传统防治措施主要是依靠中耕除草和除草剂施用,成本较高。
[0003] 玉米是重要的粮食和饲料作物,也是重要的工业原料和能源作物,在我国经济中 起着十分重要的作用。我国玉米种植区域广,杂草种类及危害情况也极为复杂,并且因耕作 制度和除草方式使杂草群落不断演替而危害玉米生长。杂草与玉米相伴而生,地上争夺阳 光和空间,妨碍田间通风透光,造成玉米群体光能利用率低;地下则争夺土壤养分、水分,导 致玉米植株营养不良,严重影响了玉米的产量和品质。同时,许多杂草是农作物病虫的天然 寄主,易导致病虫害在玉米田间传播。
[0004] 自从1942年除草剂2, 4-D问世以来,杂草防治由人工除草进入化学除草时代。此 后,除草剂新品种层出不穷,应用范围也越来越广,有效的提高了劳动生产率、降低了成本。 1971年草甘磷上市,该除草剂为内吸传导型广谱灭生性除草剂,除草效果好,且在环境中容 易降解。草甘膦能竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS) 的活性,从而阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成,扰乱生物体正常的氮代谢 而使其死亡。其在24-28小时内就可扩散到整棵植株,使其2-10天内出现枯萎或死亡。由 于草甘膦是一种非选择性除草剂,对农作物同样有毒害作用,喷施后对作物的光合作用和 代谢过程会产生一定的影响,这极大限制了草甘膦在农业生产中的应用,因此,耐除草甘膦 转基因作物的发展无疑有广泛市场。1985年,Comai等从鼠伤寒沙门氏菌中分离出了抗草 甘膦的突变基因aroA并将其转入烟草,首次获得了耐除草剂的转基因植物,之后有关抗草 甘膦新基因研究报道层出不穷,耐草甘膦转基因作物也相继研发成功并推广应用。2011年, 耐除草剂性状转基因作物种植面积为9390万公顷,占全球转基因作物种植面积的59%。同 时也减轻了农药滥用对农业环境的影响。
[0005] 耐草甘膦转基因作物得以应用的两个关键因素是:耐草甘膦基因的获得以及该基 因在转基因作物中的表达量能保证草甘膦在除草剂量施用下植株仍能生长发育正常。也就 是说,高抗草甘膦基因的发掘及利用是转基因作物成功推广的奠基石。目前,在转基因耐除 草剂植物中草甘膦抗性基因即突变的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因 最为广泛应用。
[0006] 5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和 3-磷酸莽草酸(S3P)合成5'-烯醇式丙酮酸-3'-磷酸莽草酸。可分为两类(Ming He 等,2001)。以鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌为代表的这一类具有相同氨基酸保守序列的EPSPS 合酶被称做Class I EPSPS。以农杆菌CP4、假单胞菌PG2982为代表的称为Class II EPSPS。两类EPSPS拥有各自的结构特征,且氨基酸序列相似性低于50%。从这些物种中克 隆出的EPSPS基因也相应分成了两类。一些大型国际生物技术公司已明确了 epsps基因中 对草甘膦抗性有影响的氨基酸保守序列,并申请了相关专利,构筑了严密的知识产权保护 网。就草甘膦抗性来讲,Class II EPSPS成员突变体对草甘膦表现出的抗性普遍较高。如 大面积推广的抗草甘膦玉米所含的抗性基因就是从根癌农杆菌CP4中克隆出的CP4-ep Sps 基因(Class II)。我国在草甘膦抗性菌株和基因资源的研究方面也取得重要进展。朱玉 和刘柱等分别从草甘膦极端污染的环境中分离到了两株抗性极强的菌株-荧光假单胞菌 G2(psedomonas fluorescens G2)和可变盐单胞菌HTG7(Halomonas Variabilis HTG7),并 克隆出2个结构新颖、功能明确的草甘膦抗性新基因。它们均不含专利保护的氨基酸序列 及突变位点,与之前已报道的Class I和Class II家族中的草甘膦抗性基因相似性低,显 示了有良好的开发应用前景。该基因也被广泛应用于转基因大豆、棉花和油菜等多种植物。 Heck等(2005)构建了一个分别用水稻actin 1启动子和花椰菜花叶病毒P35s启动子启动 CP4-印sps基因的表达载体,转基因玉米在高于生产应用浓度2~4倍剂量的除草剂喷施 条件下均有植株正常生长,获得了高抗草甘膦的转基因株系,并完成了商品化。Howe (2002) 等将突变后的玉米印sps基因和G0X基因一同转入玉米细胞,产生的愈伤组织经过ImM和 3mM草甘膦各筛选一个月后,再生出玉米转化植株;在植株约61cm高时喷施0. 036升/公 顷的除草剂农达(40%草甘膦)筛选抗性植株,获得了抗性品种,并完成了商品化。我国 对耐草甘膦转基因作物的研究也取得很大进步。具有我国自主知识产权的G2-ep Sps基因 被转入烟草和棉花后,获得可耐受草甘膦的能力(刘锡娟等,2007)。2008年,赫福霞等, 对G2-印sps进行植物密码子优化后转入玉米,获得了抗草甘膦转基因玉米,并建立了以 2mG2-印sps基因(优化后基因)为筛选标记的玉米转化体系。在转化实验中,愈伤组织筛 选压力为ImM的草甘膦异丙胺盐筛选15天。2010年余桂容等将2mG2-ep SpS基因转入10 个优良玉米自交系,并确定了不同自交系草甘膦的最适筛选浓度(变幅在1%。-1. 25%。), 但未达到生产上应用浓度2%。,在随后发表的文章中又将2mG2-印sps和R79-印sps (从宏 基因组文库中分离的R79菌株中克隆)构建到同一表达载体中转入玉米,获得最高可耐受 6%。的草甘膦浓度的转基因玉米。刘柱等(2004)从草甘膦的耐受浓度高达900mM可变盐单 胞菌中克隆出新的epsps基因,提示该基因有很好的应用前景。
[0007] 除草剂抗性基因能否在受体植物中高效表达产生理想的抗性性状,不仅取决于基 因的来源及碱基序列的特异性、转基因的拷贝数,而且决定于转基因表达结构和转基因表 达产物的稳定性。转基因表达结构一般是由"启动子-基因编码区-转录终止区"组成,在 单子叶植物中,高效表达的启动子一般与基因的内含子序列紧邻,内含子可明显提高基因 表达丰度,植物基因工程常用的启动子Pubiqintin、Pactin均含有内含子序列。转录终止 区不仅保证了编码区的正确转录,而且对转录产物的稳定性即半衰期有很大影响。构建理 想的转基因表达结构可使转基因高效转录,且产物稳定。转基因产物的稳定性还取决于基 因编码区的碱基组成,不同进化阶梯上的生物,其基因的碱基组成可有明显不同,异源的碱 基组成差异较大的转录产物往往会表现出不稳定现象,即易被降解,半衰期短。另外,物种 对密码子具有不同程度的偏好性,即一些密码子在特定的物种中使用频率高,而另一些密 码子在特定物种中使用频率低,这种特性会影响特定蛋白的合成速率。因此,要实现转基因 在受体植物中高效表达并产生理想性状,需要基因编码区的碱基序列适合于该基因的高效 表达,即用受体物种偏爱的密码子取代在受体物种中利用率低的密码子、改变影响mRNA寿 命的DNA片段;需要将基因编码区与高效表达的启动子融合;需要在基因的3'区连上能提 高mRNA寿命的3'尾巴区。转基因的插入位点也明显影响转基因的表达强度,因此,也需要 获得大量的转化事件,从中选择合乎目标的转基因体。

【发明内容】

[0008] 针对目前的研究现状,本发明的目的是提供一种抗除草剂草甘膦基因表达结构及 其在玉米中的应用。
[0009] 本发明所述的抗除草剂草甘膦基因表达结构,其特征在于:所述基因表达结构由 玉米Ubiqitinl基因启动子-人工合成的草甘膦耐性基因mEPSPS-水稻GluB5基因终止区 TgluB5核苷酸片段构成;其中,所述草甘膦耐性基因mEPSPS的核苷酸序列如SEQID No. 1 所示,所述水稻GluB5基因终止区TgluB5核苷酸片段的序列如SEQID No. 3所示,所述玉 米Ubiqitinl基因启动子的核苷酸序列
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