一种弧菌通用的基因敲除自杀载体及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于微生物遗传操作领域，具体涉及一种弧菌通用的基因敲除自杀载体及 其应用。
【背景技术】：
[0002] 弧菌是海洋环境中最为常见的异养细菌，至少有12种弧菌可引起人类致病，其中 霍乱弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌对人类健康危害最为严重。此外不少种类的弧菌也是水产 经济动物病原，其引发的弧菌病导致水产养殖大量经济损失。尽管很早已经发现了霍乱弧 菌和副溶血弧菌某些关键致病基因，科学家对弧菌致病机理的认识仍然严重滞后于肠杆菌 科的致病菌。缺乏成熟、便捷的遗传操作技术是弧菌分子致病机理研究的主要障碍。
[0003] 基于细菌recB⑶同源重组系统的基因敲除技术是目前在多种细菌中可以实现的 技术。在这种技术中，目的基因的框内缺失融合片段首先通过交叠PCR扩增获得，PCR产物 与自杀载体采用相同的酶酶切纯化后再连接，并转化大肠杆菌，获得带有外源片段的自杀 质粒（载体），该自杀质粒再经由供体菌接合输入到受体靶细菌中。该质粒由于自身的限 制并不能在靶细菌中复制，在正向选择压力下（通常是质粒上的抗性基因），只有基因组通 过同源重组整合了自杀质粒的靶细菌才能存活下来，形成插入突变；在反向选择压力下，插 入突变细胞发生第二次同源重组，整合态的自杀质粒脱离染色体，理论上形成一个野生型 细胞和一个基因缺失突变细胞，从而实现靶基因的敲除。由此可见，自杀载体是基于细菌 recB⑶同源重组系统的基因敲除技术的核心。
[0004] 目前基于细菌recB⑶同源重组系统的基因敲除技术在弧菌中的应用还非常少 见，仅有一些偶然成功的报道。可以成功用于大肠杆菌等细菌的同源重组的基因敲除技术 在弧菌基因敲除中存在一些明显的缺陷，包括：（1)缺乏通用性，仅限于某一个弧菌中的基 因缺失；（2) sacB被广泛用作自杀载体的致死基因，但sacB所引发的致死效应在弧菌中十 分弱，导致反向选择平板中正确的缺失突变克隆出现的比例非常低，造成大量的缺失突变 筛选工作；（3)需要对目的片段交叠PCR产物及自杀质粒进行双酶切，费时费力；(4)自杀 质粒本身较大，且带有mobl移动基因，不仅造成质粒接合转移的效率低，而且有可能引起 非特异性整合。（5)受体菌必须具有与供体菌及自杀载体不同的抗性标记，限制了常规技术 的应用。因此，当用于弧菌基因敲除时，现有自杀载体表现出明显的局限性，迫切需要发展 新的通用型自杀载体以克服上述缺陷，实现基于细菌recBCD同源重组系统的基因敲除技 术在弧菌中的广泛应用。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种弧菌通用的基因敲除自杀载体 pLP12T〇
[0006] 本发明的基因敲除自杀载体pLP12,为环状载体，其特征在于，包括PBAD启动子、阻 遏蛋白基因araC、RP4转移起始位点（oriT RP4)、氯霉素抗性基因（cat)、R6K复制起始位点 (oriVR6Ky)、多克隆位点区（MCS)和致死基因vmi480,所述的多克隆位点区（MCS)至少包含 两个Ahdl酶切位点，所述的致死基因vmi480的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第21-617位 碱基序列所示，所述的致死基因vmi480位于P_启动子下游并处于P _启动子控制之下。
[0007] 优选，所述的基因敲除自杀载体PLP12,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，含有 3871bp的碱基。
[0008] 本发明还提供了一种基因敲除自杀载体PLP12T，为线性载体，其特征在于，是将上 述基因敲除自杀载体PLP12用Ahdl酶切多克隆位点区中的两个Ahdl酶切位点后得到的线 性载体，即为基因敲除自杀载体PLP12T。
[0009] 优选，所述的基因敲除自杀载体PLP12T，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示，含有 3848bp的喊基。
[0010] 所述的P_启动子系统（包括P _启动子和阻遏蛋白基因araC)属严密型可控表 达启动子系统，葡萄糖可以完全封闭下游致死基因vmi480的表达，在阿拉伯糖的诱导下， vmi480表达被激活。根据阿拉伯糖诱导浓度不同，vmi480的表达量可受调控。oriT RP4为一 段富含AT序列，在供体菌提供转移机制的作用下，自杀质粒从此位点开始形成单链转移。 氯霉素抗性基因提供第一次整合质粒筛选的抗性标记。〇riV R6Ky为质粒进行自我复制的起 始位点。在？_启动子系统的控制下，vmi480可以表达或抑制表达。当进行反向筛选时， 在阿拉伯糖诱导下vmi480激活表达Vmi480,其具有强烈毒性。只有发生第二次同源重组 丢失质粒的细胞才能存活，第二次重组的结果就是原细胞分裂后产生一个野生型细胞和一 个基因缺失型细胞，从而实现基因敲除。多克隆位点区（MCS)方便对质粒进行酶切产生可 以与同样进行酶切的PCR产物连接的自杀载体。MCS包含二个Ahdl酶切位点，当采用Ahdl 酶切后可产生线性的自杀型T载体。在这种情况下，不需要对PCR产物进行酶切，纯化后就 直接连接该载体。
[0011] 本发明还提供了基因敲除自杀载体PLP12T在基因敲除中的应用。
[0012] 优选，所述的基因敲除自杀载体PLP12T在弧菌基因敲除中的应用。
[0013] 进一步优选，将目的基因的框内缺失融合片段与基因敲除自杀载体pLP12T连接， 得到携带目的基因的框内缺失融合片段的PLP12T，命名为pLP12T-X，pLP12T-X经转化进入 供体菌中，然后将此供体菌与受体菌混合，经接合作用将PLP12T-X转移进入受体菌，经氯 霉素选择，只有PLP12T-X整合到受体菌基因组靶位点的细胞才能存活，获得pLP12T-X整合 到受体菌基因组靶位点的目的基因插入突变型菌株，然后此目的基因插入突变型菌株在阿 拉伯糖诱导vmi480基因产生毒素Vmi480的反向选择压力下，只有发生第二次同源重组丢 失了自杀载体部分的细胞才能存活，第二次重组后，原目的基因插入突变型菌株可产生一 个基因缺失细胞和一个正常的野生型细胞，因此反向选择平板上生长的克隆主要为目的基 因缺失克隆和正常的野生型细胞克隆，经过筛选，如通过PCR检测可以筛选出目的基因缺 失的克隆，从而最终达到将目的基因敲除目的，获得目的基因缺失的菌株。
[0014] 所述的受体菌为弧菌。
[0015] 所述的供体菌为缺陷型大肠杆菌e 2163。采用缺陷型大肠杆菌e 2163作为供体 菌，不需要考虑受体菌是否具有抗生素抗性，因此大大方便了基于接合的基因敲除方法的 应用。
[0016] 与已有的自杀载体及使用方法相比，本发明具有以下有益效果：
[0017] (1)本发明的基因敲除自杀载体中采用了全新的反向选择基因vmi480,用于替代 常用的sacB基因。vmi480具有致死作用强、致死对象广泛、致死效应的发挥不受NaCl影响 的优点。这为本发明的基因敲除自杀载体广泛用于嗜盐弧菌基因敲除奠定了基础。
[0018] ⑵本发明的基因敲除自杀载体的多克隆位点引入了两个Ahdl位点，酶切后可形 成T载体，一次形成载体后，反复使用。PCR产物不用酶切，也不用考虑酶切位点，大大节省 了时间。
[0019] (3)本发明的基因敲除自杀载体摒除了一般自杀质粒中大量冗余部分，自杀载体 变小，有利于提高接合转移的频率以及正确整合的机率。
[0020] (4)基于P_启动子以及致死基因的高效性，反向选择平板上缺失突变克隆的比 率大大提高，大量减少了筛选克隆的工作。
【附图说明】
[0021] 图1为弧菌通用的基因敲除自杀载体PLP12物理图谱，当采用Ahdl酶切后即可形 成自杀载体PLP12T。
[0022] 图2为弧菌通用的基因敲除自杀载体pLP12T构建流程图。
[0023] 图3为应用弧菌通用基因敲除自杀载体对4种不同弧菌总计6个基因敲除结果检 测。M:分子量Marker;1-3 :分别对应于溶藻弧菌E0601的vah基因野生株、插入突变株、 缺失突变株的检测结果；4-6 :分别对应于霍乱弧菌HN375的degS基因野生株、插入突变 株、缺失突变株的检测结果；7-9 :分别对应于霍乱弧菌HN375的vasC基因野生株、插入突 变株、缺失突变株的检测结果；10-12:分别对应于副溶血弧菌E0680的pilO基因野生株、 插入突变株、缺失突变株的检测结果；13-15 :分别对应于副溶血弧菌E06135的ascS基因 野生株、插入突变株、缺失突变株的检测结果；16-18:分别对应于创伤弧菌ATCC27562的 impB基因野生株、插入突变株、缺失突变株的检测结果：N:代表用水做模板的阴性对照检 测结果。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是：在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0025] 以下实施例1为弧菌通用的基因敲除自杀载体PLP12T构建，实施例2-7为自杀载 体PLP12T在代表性弧菌基因敲除中的应用。溶藻弧菌广泛分布于海洋及河口环境中，是分 离弧菌中最为常见的种类，同时也是多种水产养殖动物的条件致病菌，其导致的弧菌病爆 发可引起巨大的经济损失。霍乱弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌是对人类健康危害最为严重弧 菌种类。此外，这四种弧菌彼此间也具有较大的遗传差异。因此选用这四种弧菌作为典型 代表，用于验证弧菌通用的基因敲除自杀载体PLP12T在弧菌基因敲除中的通用性。
[0026] 本实施例中所有PCR扩增引物见表1。
[0027] 表1本发明中所采用的引物
[0028]
[0031] *划线部分为酶切位点
[0032] 实施例1弧菌通用的基因敲除自杀载体pLP12T的构建（流程如图2所示）
[0033] (1)以质粒 pSW23T (Vincent Burrus 提供