绵羊FecB基因原核表达载体的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因引物设计及载体构建方法。
【背景技术】
[0002] FecB基因是在Booroola Merino羊中发现的与高繁殖率相关的主效基因， FecB基因位于绵羊6号常染色体，对绵羊的排卵率及产羔数有很大影响，（[l]Souza C J，MacDougall C，Campbell B K，et al. The Booroola (FecB)phenotype is associated with a mutation in the bone morphogenetic receptor type IB(BMPR1B)gene [J]. Journal of Endocrinology，2001， 169(2):R1-R6。 [2]MCNATTY K P，SMITH P，HUDS0N N L， et al. 0 ff-S and Braw Tal R. Development of the sheep ovary during fetal and early neonatal life and the effect of fecundity genes[J]. Journal of Reproduction and Fertility Supplement，1995,49:123-135)。该基因实际为骨形态发生蛋白IB型受体基 因（BMPR-IB，即 bone morphogenetic protein receptor IB)，在澳大利亚多胎绵羊品 种Booroola羊中BMPR-IB基因编码序列中有1个A746G点突变，（[3]Davis G H，McEwan J C,Fennessy P F，et al. Evidence for the presence of a major gene influencing ovulation rate on the X chromosome of sheep[J]. Biol Reprod. 1991，44(4):620 ; [4]Mulsant P，Lecerf F，Fabre S，et al. Mutation in bone morphogenetic protein receptor-IB is associated with increased ovulation rate in Booroola Merino ewes[J].Proc Natl Acad Sci USA. 2001，98(9):5104)，致使绵羊产羔数增加（[5] MONTGOMERY G W，LORD E A，PENTY J M，et al. The Booroola fecundity(FecB)gene maps to she印 chromosome6[J]. Genomics，1994,22:148-153. [6]LORD E A，DAVIS G H，DODDS K G?et al. Identification of Booroola carries using microsatellite markers[J]. Wool Technology and Sheep Breeding，1998,46:245-249) D 1989 年，该基因被绵、山羊遗传命 名委员会正式定名为 FecB(即 Fecundity B = Booroola)基因（[7]Dolling C H S，Piper L, Ruvinsky A. Standardized genetic nomenclature for sheep [J]. The genetics of she印.1997:593-601. h柳淑芳等（[8]柳淑芳，姜运良，杜立新.BMPR-IB和BMP15基因作 为小尾寒羊多胎性能候选基因的研究[<1].遗传学报，2003,30(8) :755-760)〇以81?1?-18 基因作为多胎性能候选基因对小尾寒羊的研究证明，BMPR-IB基因的BB基因型在多胎品种 小尾寒羊群体内为优势基因型，推测其可能是控制小尾寒羊多胎性能的主效基因或与之存 在紧密的遗传连锁。
[0003] 产羔数是衡量绵羊繁殖力的主要指标，由于绵羊产羔性状遗传力很低（0.03~ 0.1) ([9]胡锦平，白莲清，张泉福，等.湖羊繁殖与羔皮性状遗传参数和表型 参数的研究.浙江农业大学学报，1992, 18(1) : 39-43) ;[10]Davis G H，Morris C A，Dodds K G.Genetic studies of prolificacy in New Zealand sheep[J]. Animal Science，1998,67:289-297 ; [11]Fogarty N M. Genetic parameters for live weight, fat and muscle measurements, wool production and reproduction in sheep:a review[J]. Animal Breeding Abstracts, 1995, 63(3):101-143. ； [12]Casellas J,Caja G, Ferret A, Piedrafita J. Analysis of litter size and days to lambing in the Ripollesa ewe.II. Estimation of variance components and response to phenotypic selection on litter size[J]. Journal of Animal Science, 2007, 85:625-631)通过表观选择难以 提高产羔性状，影响绵羊多胎性状的因素很多，如：年龄，基因，季节变化以及绵羊的营养 状况，而基因是影响绵羊多胎性状的最主要的一个因素。FecB基因已被证明是冰岛羊，爪 洼羊，剑桥羊，美利奴羊肉用、毛用多胎品系（[13]王启贵，钟发刚，李辉等.绵羊BMPR-IB 基因多态性与其产羔数的相关研究[J].草食家畜，2003,（2) :20-23)，小尾寒羊（[14]王 根林，毛鑫智，Davis G H.等.DNA分析发现我国湖羊和小尾寒Booroola(FecB)多胎基因 [J].南京农业大学学报，2003, 26⑴；104-106)，以及多浪羊（[15]陈晓军，钟发刚，罗淑 萍，等.多浪羊BMPR-IB基因多态性的初步研究[J].新疆农业科学，2004,41(1):6-9.) 等绵羊品种中发现对其繁殖力有很大效应的主基因。目前检测绵羊FecB基因的方法主要 有PCR-RFLP和PCR-SSCP技术[16]储明星，狄冉，叶素成，等.绵羊多胎主效基因FecB分 子检测方法的建立与应用[J].农业生物技术学报，2009,17(1) :52-58.)，两种方法均耗时 费力，成本较高。本研究通过克隆小尾寒羊FecB基因并构建原核表达载体，表达纯化重组 FecB基因蛋白，通过多克隆抗体制备出FecB基因的抗体，为绵羊FecB基因ELISA检测方法 的建立提供基础，也为绵羊多胎品种的选育提供思路。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种绵羊FecB基因原核表达 载体的构建方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种绵羊FecB基因原核表达载体的 构建方法，其特征在于通过反转录PCR扩增FecB基因片段，反转录PCR扩增方法为：94°C预 变性41^11 ;941€4〇8,591€4〇8,72°(：11111115〇8,35个循环，72°(：1〇111111，4°(：保存 ；1%的琼脂 糖检测。
[0006] 所述的绵羊FecB基因原核表达载体的构建方法，还包括有：
[0007] 上游引物 BamHIF ：5, -GGATCCAACATGCTTTTGCGAAGTTC-3?,
[0008] 下游引物 EcoRIR:5' -GGAATTCCAGAGCTTAATGTCCTGGGACT-3'，
[0009] PCR扩增片段为：1509bp，上游引物是BamHI和下游引物是EcoRI，下方划线为 引物上添加的酶切位点。
[0010] 所述的绵羊FecB基因原核表达载体的构建方法，将双酶切的FecB基因PCR扩增 片段和经双酶切的pET30a载体质粒T4连接酶作用下连接，转化感受态大肠杆菌菌株；
[0011] 双酶切体系如下：BamHI0? 5 y L，EcoRI0? 5 y L，10XK Buffer 2 y L，质粒载 体DNA 7 y L，加去离子水至20 y L ;37°C酶切4h ;2 %的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物， 切胶回收空载体和目的基因片段；用T4连接酶切后目的基因片段和空载体；连接体系： T4DNA连接酶lyL，双酶切后的表达质粒载体1.5yL，双酶切后目的基因片段10yL， Buffer 2. 5 y L，加无菌水至20 y L ;16°C过夜连接；将连接产物加入100 y L感受态大肠杆 菌BL21 (DE3)中，挑取白色斑点，于含卡纳的液体培养基中摇床6h，菌液PCR检测阳性克隆， 提取重组质粒，双酶切鉴定，阳性克隆送上海生工测序。
[0012] 所述的绵羊FecB基因原核表达载体的构建方法，绵羊FecB基因编码区（⑶S)核 酸序列为：
[0013]
[0014]
[0015] 本发明的有益效果：
[0016] 本发明构建了 FecB基因的原核表达载体，该重组载体转化入感受态大肠杆菌 BL21(DE3)体内后经过诱导可体外表达出FecB蛋白，免除了从组织中提取蛋白的繁琐步 骤。为研究该蛋白创造有效途径。
【附图说明】：
[0017] 图1BMPR-IB基因P1引物PCR扩增结果。
[0018] 图2 BMPR-IB基因AvaII限制性内切酶酶切结果；
[0019] 图中：M.DL2000DNAMarker;l-2.BB型；3.++ 型；4-5.B+型；
[0020] 图3重组质粒的双酶切鉴定；
[0021] 图中：M.D