一种提高乳酸菌乙醇胁迫抗性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高乳酸菌乙醇胁迫抗性的方法，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 乳酸菌作为一类重要的工业微生物，菌体及其代谢产物广泛应用于食品、医药、饲 料、精细化学品等工业领域中。在工业生产中以及作为益生菌在人体胃肠道系统中都不可 避免的面临着来自外界环境的多种环境胁迫，包括酸胁迫、乙醇胁迫、氧胁迫、盐胁迫等，严 重限制着乳酸菌生长性能和发酵力。
[0003] 乙醇属有机溶剂，对菌体的毒害主要表现在对细胞膜的破坏上。乙醇渗入膜结构 改变它们的组织和功能，乙醇不仅抑制细菌的生长，乙醇浓度过高还会影响菌体的新陈代 谢、生理活性、影响基体的酶活性等，甚至导致菌体死亡。因此，提供一种提高乳酸菌乙醇胁 迫抗性的方法尤为重要。
[0004] 本发明通过在乳酸乳球菌中过量表达ArgG和ArgH蛋白，调节天冬氨酸到精氨酸 的代谢通路，从而实现了乳酸乳球菌对于乙醇胁迫抗性能力的提高。
【发明内容】
[0005] 为了克服上述问题，本发明提供了一种提高乳酸菌抵御乙醇胁迫的方法，从而提 高乳酸乳球菌对于乙醇胁迫条件的适应能力。
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种提高乳酸菌乙醇胁迫抗性的方法，是在乳酸菌中 过表达精氨酰琥珀酸合成酶ArgG或者精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述ArgG的氨基酸序列是SEQIDNO. 1所示的序 列。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述ArgG的核苷酸序列是SEQIDN0. 2所示的序 列。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述ArgH的氨基酸序列是SEQIDN0. 3所示的序 列。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述ArgH的核苷酸序列是SEQIDN0. 4所示的序 列。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述方法是将编码ArgG或者ArgH的基因序列连接 到表达载体上获得重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主乳酸菌中并诱导重组菌表达ArgG 或者ArgH，再将重组菌置于乙醇胁迫环境中。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述诱导重组菌表达是将在GM17培养基中，使用 nisin(-种乳酸链球菌素）进行诱导。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148、pNZ8149或pNZ8150。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述宿主乳酸菌为LactococcuslactisNZ9000。
[0016] 本发明还提供一种乙醇胁迫抗性提高的重组乳酸菌，其特征在于，所述重组乳酸 菌过表达了精氨酰琥珀酸合成酶ArgG或者精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述重组乳酸菌以LactococcuslactisNZ9000为 宿主、PNZ8148为载体过表达了氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示的ArgG。
[0018] 本发明的有益效果：
[0019] 通过采用在乳酸菌中过量表达精氨酰琥珀酸合成酶（ArgG)或精氨酰琥珀酸裂解 酶（ArgH)的方法，显著提高了乳酸菌的乙醇胁迫抗性能力。采用本发明方法，在5%乙醇胁 迫条件下，使重组菌株 L.lactis NZ9000(pNZ-argG)和 L.lactis NZ9000(pNZ-argH)相对 于对照菌株的生物量分别提高了 25. 7%和21. 2%;同时，过表达ArgG或ArgH的重组菌，在 15%乙醇胁迫5h后，存活率分别为对照菌株的5. 97和4. 65倍。
【附图说明】
[0020] 图1 :重组质粒pNZ8148-argH的结构图；
[0021] 图2:重组菌株蛋白电泳图；其中，M:蛋白Marker;G:L.lactis NZ9000(pNZ-argG)；H：L.lactisNZ9000(pNZ-argH)；VEC：L.lactisNZ9000(pNZ8148)；
[0022] 图3 :5%乙醇胁迫条件下，重组菌株与对照菌株生长性能对比；
[0023] 图4 :15%乙醇胁迫条件下，重组菌株与对照菌株存活率对比。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例对本发明做更详细的说明。
[0025] 实施例1重组菌株的构建
[0026] 从NCBI数据库的L. casei Zhang中得到ArgG和ArgH蛋白的基因序列（分别如 SEQ ID NO. 2、SEQ ID N0. 4所示），并将其克隆到乳酸乳球菌表达质粒pNZ8148上，获得重 组质粒pNZ8148-argG和pNZ8148-argH，再将其电转入宿主菌L. lactis NZ9000中，得到重 组菌株 L.lactis NZ9000 (pNZ-argG)和 L.lactis NZ9000 (pNZ-argH) 〇
[0027] 具体如下：
[0028] 根据argG和argH的基因序列分别设计引物ArgGF、ArgGR、ArgHF和ArgHR(表1)， 以L. casei Zhang的基因组为模板进行PCR扩增，获得argG和argH基因片段。将PCR产 物和载体PNZ8148分别用Spe I和Sph I双酶切，酶切产物经纯化后，进行连接。连接产物 电转化L. lactis NZ9000感受态细胞，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶 切验证，片段大小正确后，经测序验证正确后最终获得含有正确重组质粒的菌株L. lactis NZ9000(pNZ-argG)和 L. lactis NZ9000(pNZ-argH)〇
[0029] 电转化条件为：1 yL质粒中与40 yL的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中， 冰上放置l〇min。电压2000V，电容25yF，电阻200Q。电击完毕后，立即向电转杯中加入 lmL含有20mM MgCljP 2mM CaCl 2的GM17培养基（GM17培养基配方：M17培养基+0. 5% glucose)。然后置于30°C静置培养1. 5h，涂布于含有氯霉素的GM17平板上，培养36h，挑取 转化子验证。
[0030] 表1引物
[0031]
[0032] 实施例2ArgG和ArgH蛋白的诱导表达与检测
[0033] 诱导重组菌L.lactisNZ9000(pNZ-argG)和L.lactisNZ9000(pNZ-argH)表达 ArgG和ArgH蛋白，并用SDS-PAGE蛋白电泳检测重组菌株中ArgG和ArgH蛋白的表达情况， 发现与ArgG和ArgH蛋白大小相似的条带的量显著增加。
[0034] 具体过程如下：
[0035]将菌株 L. lactis NZ9000 (pNZ8148)(即含有 pNZ8148 空质粒的 L. lactis NZ9000 菌株）和重组菌 L. lactis NZ9000(pNZ-argG)和 L. lactis NZ9000(pNZ-argH)接种于含有 10 y g/mL氯霉素的GM17(5mL)培养基中，30°C静置培养过夜，以4%的接种量转接至50mL 含有10 y g/mL氯霉素的GM17培养基中，待生长至0D6M0. 4时加入10ng/mL的nisin (-种 乳酸链球菌素）诱导培养8h，收集诱导后的细胞，经50mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.4)离心 洗涤两次后重悬于相同的缓冲液中。将菌悬液置于冰上超声破碎15min，离心收集上清液， 进行SDS-PAGE分析。
[0036] 经SDS-PAGE分析，重组菌 L.lactisNZ9000 (pNZ-argG)和 L.lactis NZ9000 (pNZ-argH)分别成功的表达了ArgG和ArgH蛋白。SDS-PAGE中，在分子量约为45kDa 和52kDa处的蛋白质条带显著变厚重，与目标蛋白ArgG和ArgH的分子量基本一致，说明成 功地在L.lactisNZ9000中表达了ArgG和ArgH蛋白。
[0037] 实施例3乙醇胁迫下生长性能试验
[0038] 对于考察菌株在胁迫条件下的生长情况，将菌株L. lactis NZ9000(pNZ8148)和 L. lactis NZ9000 (pNZ-argG)和 L. lactis NZ9000 (pNZ-argH)接种于含有 10 yg/mL 氯霉素 的GM17 (5mL)培养基中，30°C静置培养过夜，以4%的接种量转接至50mL含有10 y g/mL氯 霉素的GM17培养基中，待生长至0D6M0. 4时加入10ng/mL的nisin，诱导培养至0D 2. 0。将 诱导后的培养液以2%的接种量转接至新鲜的GM17 (含10 y g/mL氯霉素，10ng/mL nisin， 5%乙醇，v/v)培养基中。分别测定重组菌株和对照菌株在胁迫条件下的生长性能。
[0039] 结果如图3所示。经生长性能试验分析，L. lactis NZ9000 (pNZ-argG)和L. lactis NZ9000 (pNZ-argH)相对对照菌株生物量显著提高，分别提高25. 7%和21.2%，说明在 L. lactis NZ9000中表达了ArgG和ArgH蛋白后，菌株乙醇胁迫抗性显著提高。
[0040] 实施例4乙醇胁迫条件下耐受性试验
[0041] 对于考察菌株对乙醇的耐受性分析试验，分别测定了重组菌株和对照菌株在15% 乙醇胁迫条件下的存活率。
[0042] 具体操作方式如下：将菌株诱导培养至0D2.0,离心收集细胞，经0.85%的生理 盐水洗涤两次后重悬于等体积的新鲜的含有15%乙醇的GM17中，胁迫不同的时间。胁迫 后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积生理盐水中，取10 y L重悬液，稀释不同梯度点种于 GM17平板上测定活菌数和存活率。
[0043] 经耐受性实验分析（结果如图4所示），在15 %的GM17中胁迫5h后，重组菌株 L.lactis NZ9000(pNZ-argG)和 L.lactis NZ9000(pNZ-argH)的存活率分别是对照菌株的 5. 97和4. 65倍，说明重组菌株对乙醇胁迫的耐受性显著提高。
[0044] 结合实施例3、4分析，可知在L. lactisNZ9000中表达了 ArgG或ArgH蛋白后，菌 株乙醇耐受性显著提高。说明通过在L. lactisNZ9000中表达ArgG或ArgH蛋白的方法可 以提高乳酸乳球菌乙醇胁迫抗性。
[0045] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种提高乳酸菌乙醇胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法是在乳酸菌中过表达 精氨酰琥珀酸合成酶ArgG或者精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ArgG的氨基酸序列是SEQ ID NO. 1 所示的序列。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ArgH的氨基酸序列是SEQ ID NO. 3 所示的序列。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是将编码ArgG或者ArgH的基因 序列连接到表达载体上获得重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主乳酸菌中并诱导重组菌 表达ArgG或者ArgH，再将重组菌置于乙醇胁迫环境中。6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pNZ8148、pNZ8149或 PNZ8150。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述宿主乳酸菌为Lactococcus Iactis NZ9000。8. -种重组乳酸菌，其特征在于，所述重组乳酸菌过表达了精氨酰琥珀酸合成酶 ArgG09.根据权利要求8所述的重组乳酸菌，其特征在于，所述重组乳酸菌是过表达了氨基 酸序列如SEQ ID NO. 1所示的ArgG。10. 权利要求8-9任一所述重组乳酸菌在食品、饲料、精细化学品领域的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种提高乳酸菌乙醇胁迫抗性的方法，属于生物工程技术领域。本发明方法通过在乳酸乳球菌L.lactis？NZ9000中过量表达了来源于干酪乳杆菌L.casei？Zhang的argG和argH基因，得到了一株乙醇胁迫抗性能力显著提高的重组乳酸乳球菌L.lactis？NZ9000(pNZ-argG)和L.lactis？NZ9000(pNZ-argH)。在5％乙醇胁迫条件下，重组菌株L.lactis？NZ9000(pNZ-argG)和L.lactis？NZ9000(pNZ-argH)相对于对照菌株生物量分别提高了25.7％和21.2％；15％乙醇胁迫5h后，存活率分别为对照菌株的5.97和4.65倍。
【IPC分类】A23K1/16, A23L1/30, C12N1/21, C12N15/74
【公开号】CN105063077
【申请号】CN201510591053
【发明人】张娟, 陈坚, 张明阳, 堵国成, 朱政明, 唐诗
【申请人】江南大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年9月16日