一种利用Tn7转座元件整合表达外源蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体是一种利用Τη7转座元件整合表达外源蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建方法。
【背景技术】
[0002]在食品和药品用活性蛋白质的生产中，采用基因工程技术对活性蛋白质基因进行异源表达已经被证明是提高产量和纯度的有效方法。作为常用的基因工程宿主菌，大肠杆菌生长繁殖迅速，培养简单，发酵成本较低，也没有复杂的蛋白酶系，重组蛋白较稳定，因而成为生产重组蛋白质的良好宿主。但大肠杆菌用于生产食品工业用酶仍存在一些缺陷，主要有:1.大肠杆菌不是公认为安全的菌株；2.在重组大肠杆菌的高密度发酵中，表达质粒往往由于结构不稳定性和分离不稳定性而易于丢失。为了保持重组大肠杆菌表达质粒的遗传稳定性，往往需要施加选择压力，目前最常用的选择压力是添加抗生素。添加抗生素选择压力无疑会增加菌体的代谢负荷，增加生产成本，引起终产品中抗生素残留，引起抗性基因在环境中的扩散。对于食品和药物用重组蛋白质，产品中残留抗生素已逐渐被世界各国禁止。
[0003]公认为安全的微生物主要有真菌中的曲霉菌和酵母菌、细菌中的乳酸菌和枯草芽孢杆菌等，其中天然枯草芽孢杆菌在食品工业中已有悠久的应用历史，人们对其遗传背景和生理特性的了解仅次于大肠杆菌；重组枯草芽孢杆菌生长速度较真菌快得多，能将酶蛋白分泌到细胞外，无需细胞破碎，分离纯化工艺简便，并且表达产物可溶，可正确折叠，并具有生物活性；因此采用枯草芽孢杆菌整合表达食品用活性蛋白质基因是较好的选择。整合的外源基因随枯草芽孢杆菌染色体DNA的复制而复制，在大多数情况下相当稳定，重组菌在不使用抗生素选择压力下可以连续传代培养而不丢失基因表达盒，可从源头上解决抗生素问题，这对生产食品用活性蛋白质产品十分有意义。
[0004]将外源基因整合到染色体上可采用同源重组和转座重组的方法，传统的RecA和ARed同源重组系统重组发生的频率较低，操作繁琐，但也可构建单拷贝的整合表达枯草芽孢杆菌和更多拷贝的整合表达枯草芽孢杆菌(李晓明等，一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产a-乙酰乳酸脱羧酶的方法，专利号ZL 2010 I 0271749.1 ;李晓明等，一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达淀粉酶的方法，专利号ZL 2010 I 0563646.2 ；廖东庆等，将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一个整合位点的方法，专利号ZL 2010 10563647.7)。同源重组整合存在的缺点是仍然需要在所整合的DNA片段中保留抗生素基因，以便筛选出同源交换产生的重组子。而与同源重组法相比，转座重组不需要将抗生素抗性基因整合到枯草芽孢杆菌染色体，并且可以将含有抗性基因和转座酶的整合质粒驱除出宿主菌，得到遗传稳定的外源基因整合表达。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种利用Tn7转座元件整合表达外源蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建方法，以解决同源重组整合仍然需要在整合片段中保留抗生素基因的问题。
[0006]本发明达到上述目的的技术方案如下:
[0007]1.一种利用Τη7转座元件整合表达外源蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建方法是通过构建一种用于在枯草芽孢杆菌的转座整合质粒，插入外源蛋白基因及其表达元件后转化枯草芽孢杆菌，通过诱导产生Τη7转座酶TnsABCD，将外源蛋白基因及其表达元件转座整合到枯草芽孢杆菌染色体glms基因下游3’端的attTn7位点；然后通过变温培养，将培养温度从26?30°C提高到33?37°C，使转整合表达质粒上的温度敏感复制子失去作用，得到不再保留含有抗生素抗性基因和Tn7转座酶的转座整合质粒的重组枯草芽孢杆菌。将菌落转到不含抗生素的液体营养培养基上培养，能表达出活性蛋白质的菌株即为所需的转座整合表达外源蛋白基因的重组枯草芽孢杆菌。
[0008]上述的营养培养基是常规的发酵营养培养基，包括蛋白胨或水解蛋白I?50g/L，酵母提取物I?25g/L，氯化钠I?15g/L。
[0009]2.利用Tn7转座元件将外源蛋白基因及其表达元件转座整合到枯草芽孢杆菌，该方法的步骤为:构建一种用于枯草芽孢杆菌的转座整合质粒，插入外源蛋白基因及其表达元件后转化枯草芽孢杆菌，通过诱导产生Τη7转座酶TnsABCD，将外源蛋白基因及其表达元件转座整合到枯草芽孢杆菌染色体glms基因下游3’端的attTn7位点。
[0010]上述用于枯草芽孢杆菌的转座整合质粒，包含有下列组分:能在大肠杆菌中复制质粒的复制子和能在枯草芽孢杆菌中复制质粒的温敏复制子，含有抗生素抗性基因、转座子Tn7左右臂盒子、多克隆位点、Τη7转座酶TnsAB⑶片段及其诱导表达元件。
[0011]上述可用于大肠杆菌宿主中复制质粒的复制子可以是pBR322 ori，或colEl ori ；可用于枯草芽孢杆菌中复制质粒的温敏复制子是pWVOl ori/ts，其特点是在28°C左右可以行使复制功能，但在35°C左右时失去复制能力。
[0012]上述可在枯草芽孢杆菌中使用的抗生素抗性基因可以是氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、红霉素抗性基因或壮观霉素抗性基因等。该抗生素抗性基因克隆于Tn7左臂和右臂之外，在转座重组时不会被转座整合到枯草芽孢杆菌染色体上。
[0013]Τη7转座酶TnsAB⑶是用来识别和剪切Τη7转座片段、识别attTn7转座位点和促使Tn7转座片段插入到该位点。上述的Τη7转座酶TnsAB⑶可以用阿拉伯糖操纵子，包括抑制子araC和启动子Pbad来诱导表达，或用乳糖操纵子，包括阻遏基因lacl，操纵基因IacO和启动子IacP来诱导表达。
[0014]上述的用于枯草芽孢杆菌转座整合表达的外源蛋白基因，可以是酶、抗菌肽等活性蛋白质基因。上述的外源蛋白基因的表达元件，包括以下组分:能在枯草芽孢杆菌中高效转录的启动子如P43启动子，或Pamy启动子；高效分泌的信号肽片段如sacB信号肽片段，或amyQ信号肽片段。上述的外源蛋白基因及其表达元件克隆于Tn7左臂和右臂之间的多克隆位点。
[0015]上述的用于转座整合的枯草芽孢杆菌宿主为枯草芽孢杆菌168衍生菌株如1Α751，WB600, WB800 等。
[0016]本发明的优点是:
[0017]本发明利用Τη7转座元件的高整合效率，容易地得到外源蛋白基因在枯草芽孢杆菌染色体上的定点整合重组；同时利用温敏复制子的作用，通过变温培养可将含有抗生素抗性基因的整合质粒驱除，得到不含抗生素抗性基因和转座酶的遗传稳定的转座整合重组菌，在发酵该重组菌生产活性蛋白质时也不需要加入抗生素，符合食品安全的要求。
【具体实施方式】
[0018]以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述，但是这些实施例不应当被理解为对本发明的限制。
[0019]实施例1
[0020]本实施例说明利用Tn7转座元件转座整合表达β -葡聚糖酶基因的重组枯草芽孢杆菌构建方法。
[0021]本实施例的β -葡聚糖酶基因是来自Bacillus subtilis的β -葡聚糖酶基因。β-葡聚糖酶基因转座整合重组枯草芽孢杆菌表达菌株的构建具体如下:
[0022]1、将含有araC(阿拉伯糖操纵子中的抑制子)，Pbad(araBAD启动子)，大肠杆菌复制子PBR322 ori和bla (氨节抗性基因)的质粒，如Invitrogen的大小为4.1kb的质粒pBAD/His-A，用 BspHI 酶切 pBAD/His-A，去除约 Ikb 的 bla 片段，回收 3.1kb 片段。
[0023]2、以含有枯草芽孢杆菌温敏复制子pWVOl ori/ts,氯霉素抗性基因cat的质粒，如南宁新科健生物技术有限责任公司保藏的质粒PAW016为模板，用引物 AflII1-CmFOR:gcACATGTttataaaagccagtcattag，和引物 Afllll-wvOltsRE:gaACATGTgatcattttgtttattgcaattg，PCR 扩增约 3kb 的 cat+pWVOl ori/ts 片段，将 PCR 产物跑胶，回收。
[0024]3、用AflIII酶切PCR步骤2的PCR产物，纯化；与步骤I的pBAD/His-A的3.1kbBspHI片段连接，转化到大