一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体及制备方法_4

文档序号:9344275阅读:来源:国知局
共表达基因转移 体转染牛胎儿成纤维细胞、肌肉卫星细胞,并分别设置阴性对照。
[0184] Real-time PCR检测各顺反子表达情况,根据Real Time PCR引物设计原则,设计 MSTN、FAD3、GAPDH 的引物序列。
[0185] 表 1RealTimeRT-PCR检测中的MSTN、FAD3 和GAPDH引物序列
[0186]
[0187] RealTimeRT-PCR
[0188] a、样品的收集
[0189] 分别收集转染组和对照组的牛胎儿成纤维细胞和肌肉卫星细胞。提取各组细胞的 总RNA,反转录为cDNA。并进行Real Time PCR反应。
[0190] b、反转录cDNA反应体系如下:
[0191] (1)
[0192]
[0195] b、Real Time RT-PCR 反应体系
[0196]
[0197]
[0198] c、RealTimePCR反应条件:95°C30sec,95°C5sec- 6CTC34sec(40cycles) 〇
[0199] 本实验重复三次,并通过SPASS进行差异显著性分析。Real-time PCR检测实验组 与对照组中MSTN、FAD3表达情况,结果显示MSTN基因在肌肉卫星细胞中表达量下调,下调 率为61%,如图15所示,并显示shRNA对MSTN有较强的抑制作用;FAD3基因在牛胎儿成纤 维细胞和肌肉卫星细胞中具有显著性差异,在肌肉卫星细胞中的表达量是在成纤维细胞中 的4. 9倍,如图16所示,显示MRF4有较强的肌肉组织表达特异性。
[0200] DsRed表达情况,肌卫星细胞DsRed表达高于成纤维细胞DsRed的表达量。肌卫星 细胞DsRed表达如图17所示。成纤维细胞DsRed表达如图18所示。图19是DsRed基因在 1 :肌肉卫星细胞;2 :成纤维细胞;3 :水对照中RT-PCR电泳图,显示DsRed基因在RNA水平, 在肌卫星细胞表达量远高于成纤维细胞,而在水中无表达,上述均显示MRF4有较强的肌肉 组织表达特异性。
[0201] 上述实验结果表明,本发明所构建的MAR-MRF4-shRNA-MRF4-FAD3-IRES-DsRed三 顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体,可以有效的在细胞水平表达,并且在肌卫星细胞 可以显著的上调外源过表达基因的表达,下调内源干扰基因的表达,起到了过表达与干扰 载体共同发挥的作用,而且表明具多基因肌肉特异性表达特征。无任何质粒载体主干序列 和任何抗性基因,是安全有效的新型多基因转移体。
[0202] 以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人 员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体,其特征在于,基因转移体包括MARs牛核 基质结合区、以牛肌肉抑素第三号外显子为靶点的小发夹RNA、MRF4、MRF4为优化合成的肌 肉特异启动子、FAD3为人源化n-3去饱和酶基因、IRES为内部核糖体进入位点、DsRed红色 荧光蛋白基因和终止信号区SV40 polyA,所述独立基因转移体无原核主干载体序列。2. 根据权利要求1所述的三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体,其特征在于,所 述的基因转移体的全序列为SEQ NO. :17。3. 根据权利要求1所述的三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体,其特征在于,置 换CMV的肌肉特异性启动子MRF4的序列为SEQ ID NO :9 ;根据"肌肉特组织特异性启动子 生物信息学设计路线"优化MRF4序列,在两端添加Kpnl和Smal酶切位点及保护碱基,将序 列送至takara公司,进行人工合成。4. 根据权利要求1所述的三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体,其特征在于,置 换U6的MRF4的序列为SEQ ID NO :9 ;通过如下引物进行PCR获得: MRF4-F 正义链,5'到 3' :SEQ ID N0:1; MRF4-R 反义链,5'到 3' :SEQ ID N0:2。5. 根据权利要求1所述的三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体,其特征在于, FAD3的序列为SEQ ID NO : 10 ;通过如下引物进行PCR获得: FAD3-F 正义链,5'到 3' :SEQ ID NO :3 ; FAD3-R 反义链,5'到 3' :SEQ ID N0:4。6. 根据权利要求1所述的三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体,其特征在于, IRES的序列为SEQ ID NO : 11 ;通过如下引物进行PCR获得: IRES-F 正义链,5'到 3,:SEQ ID NO :5 ; IRES-R 反义链,5'到 3' :SEQ ID N0:6。7. 根据权利要求1所述的三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体,其特征在于, DsRed基因为SEQ ID NO: 12;通过如下引物进行PCR获得: DsRed-F 正义链,5'到 3,:SEQ ID NO :7 ; DsRed-R 反义链,5'到 3' :SEQ ID NO :8。8. -种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体的制备方法,其特征在于,包括如下 步骤: 51、 ,人工合成MRF4,并用MRF4置换初始载体pMAR-shRNA-U6-CMV-FSTN中的CMV,得 pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN ; 52、 用克隆的 MRF4 置换 pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN 中的 U6,得 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FSTN ; 53、 用克隆的 FAD3 置换 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FSTN 中的 FSTN,得 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3 ; 54、 进行 IRES 序列的克隆,并连入 FAD3 下游,得 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES ; 55、 克隆 DsRed,连入 IRES 下游,构建质粒载体 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsR ed ; 56、 用Xhol I、Afl II对步骤S5所得的质粒载体双酶切,电泳分离,获得三顺反子肌肉 特异双向共表达基因转移体MAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed。9.根据权利要求8所述的一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体的制备方法, 其特征在于,所述步骤Sl具体包括如下步骤: SI 1、根据"肌肉特组织特异性启动子生物信息学设计路线"优化MRF4序列,在两端添 加Kpnl和Smal酶切位点及保护碱基,并将序列送至takara公司,进行人工合成; 512、 将步骤Sll合成的MRF4肌肉特异启动子序列连接到PMDlOT-Simple载体中,挑取 穿刺菌加入到LB液体培养基中37°C摇菌14-16h,通过菌液PCR检测所挑菌落是否为阳性, 将阳性菌液送去测序; 513、 选择测序结果正确的菌液提取质粒,通过Kpnl和Smal双酶切回MRF4片段; 514、 通过Kpnl和Smal双酶切置换CMV。 步骤S2具体包括如下步骤: 521、 根据肌肉特异性启动子MRF4序列设计引物,并在MRF4序列两端添加EcoRl和 BamHl酶切位点及保护碱基; 522、 通过PCR.扩增得到MRF4片断, 523、 将所得的MRF4片断进行测序,得片断大小为1027bp ; 524、 通过EcoRl和BamHl酶切所得的MRF4片断,置换U6 ; 所述步骤S3具体包括如下步骤: 531、 根据本实验室设计的FAD3人源化片段序列设计引物,并在FAD3人源化片段两端 添加Smal和Notl酶切位点及保护碱; 532、 通过PCR技术从构建的重组载体上获得FAD3片断; 533、 将所得FAD3片断进行测序,得片断大小1342bp ; 534、 将所得的FAD3片断经Smal和Notl酶切,置换FSTN ; 所述步骤S4具体包括如下步骤: 541、 设计IRES的特异性引物; 542、 通过PCR技术从构建的重组载体上获得IRES片断; 543、 将得到IRES片断进行测序,得IRES片断的大小为608bp ; 544、 将IRES片断与FAD3的下游无缝连接; 所述步骤S5具体包括如下步骤: 551、 根据DsRed序列设计引物,并在DsRed两端添加Notl和Mlul酶切位点及保护碱 基; 552、 通过PCR技术从重组载体上获得DsRed片断; 553、 将所得的DsRed片断进行测序,得片断大小为691bp ; 554、 将所得的DsRed片断经Notl和Mlul酶切,连入IRES的下游,得质粒载体pMAR-s hRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed ; 所述步骤S6具体包括如下步骤: 561、 对鉴定正确的pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed载体在含有卡那霉素的 液体LB培养基中培养并提质粒; 562、 通过 Xho I 和 AflII 对质粒载体 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed 进行 双酶切,琼脂糖凝胶电泳后回收获得三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体MAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed-SV40 polyA。
【专利摘要】本发明公开了一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体及其制备方法,该基因转移体包括MARs牛核基质结合区、以牛肌肉抑素第三号外显子(926-947位点)为靶点的小发夹RNA(shRNA)、MRF4、MRF4为优化合成的肌肉特异启动子、FAD3为人源化n-3去饱和酶基因、IRES为内部核糖体进入位点、DsRed红色荧光蛋白基因和终止信号区SV40?polyA,所述独立基因转移体无原核主干载体序列。本发明首次把RNA干扰技术与肌肉特异过表达FAD3、DsRed结合,实现了敲减与反向过表达相关基因同时进行,为安全高效地改善多基因控制的性状如肌肉、疾病相关性状等提供新的思路和途径。
【IPC分类】C12N15/66, C12N15/79
【公开号】CN105063079
【申请号】CN201510519792
【发明人】李光鹏, 郭晶, 广璐, 张英, 白春玲, 魏著英, 扈廷茂
【申请人】内蒙古大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月15日
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