一种无氮固体培养基及利用其鉴定自生固氮菌是否分泌氨的方法

文档序号:9344362阅读:1245来源:国知局
一种无氮固体培养基及利用其鉴定自生固氮菌是否分泌氨的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及培养基及固氮技术领域,具体涉及一种无氮固体培养基及利用其鉴定 自生固氮菌是否分泌氨的方法。
【背景技术】
[0002] 生物固氮是极少数原核生物才具备的生物化学特性,能够固氮的微生物可分为2 大类:共生固氮菌和自生固氮菌。
[0003] 共生固氮菌是指能够进入高等植物体内,与寄主植物共同生活,由植物提供能量 物质,作为回报,细菌则把氮气转化为氨供植物吸收利用。这类固氮菌在寄主植物体外生长 时通常是不固氮的,它们通常只在豆科作物上才能发挥其固氮功能。
[0004] 自生固氮菌是指在生长过程中就能够固氮的菌,它无需进入植物体内,在土壤、植 物根际和植物根表等生态环境下均能固氮。因此自生固氮菌可以在任何植物根际固氮。自 生固氮菌除本身固氮能力强弱之外,能否把固定的氮营养分泌到细胞外(即泌氨能力)供植 物或其它生物利用,也是人类需要考虑的重要因素。
[0005] 在将自生固氮菌用于微生物肥料生产时,如果所用的菌株不能将固定的氮营养分 泌出来,那它促进植物生长的效果就很弱。如何鉴定自生固氮菌是否可以把固定的氮营养 分泌到胞外,对筛选真正有效的固氮菌用于微生物肥料生产具有重要意义。

【发明内容】

[0006] 为了克服现有技术中存在的缺点和不足,本发明的目的在于提供一种无氮固体培 养基及利用其鉴定自生固氮菌是否分泌氨的方法,该方法简单易行,可准确鉴定自生固氮 菌是否分泌氮营养到胞外。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现:一种无氮固体培养基,每升无氮固体培养 基由以下原料组成: K2HP04 0 . 5-2g MgS04 ? 7H20 0. 1-0. 5g CaCl2 ? 2H20 0. 05-0. 15g 葡萄糖 7-13g FeS04 ? 7H20 0? 005-0. 02g NaMo04 ? 2H20 0. 005-0.0 lg 琼脂 l〇_20g 蒸馏水 余量。
[0008] 优选的,每升无氮固体培养基由以下原料组成: K2HP04 0 . 5-1 g MgS04 ? 7H20 0. 1-0. 3g CaCl2 ? 2H20 0. 05-0. lg 葡萄糖 7-10g FeS04 ? 7H20 0? 01-0. 02g NaMo04 ? 2H20 0.005-0.01 g 琼脂 l〇_15g 蒸馏水 余量。
[0009] 更为优选的,每升无氮固体培养基由以下原料组成: K2HP04 1 g MgS04 ? 7H20 0. 2g CaCl2 ? 2H20 0. lg 葡萄糖 l〇 g FeS04 ? 7H20 0.01 g NaMo04 ? 2H20 0.008 g 琼脂 15g 蒸馏水 余量。
[0010] -种利用无氮固体培养基鉴定自生固氮菌是否分泌氨的方法,它包括以下步骤: 步骤一:将配方量的 K2HP04、MgS04 ? 7H20、CaCl2 ? 2H20、葡萄糖、FeS04 ? 7H20、 NaM〇04 ? 2H20、琼脂和蒸馏水混合后搅拌均匀得到无氮固体培养基; 步骤二:制备双层平板,将步骤一得到的无氮固体培养基在118-124°C灭菌15-25分 钟,待灭菌后的无氮固体培养基温度降至46-48°C时加入指示菌,每100毫升无氮固体培养 基加1毫升指示菌,将加入指示菌的无氮固体培养基立即混匀倒入无菌培养皿,控制无氮 固体培养基的厚度在2. 2-2. 8毫米,待无氮固体培养基凝固后再倒入厚度为0. 5至1毫米 的一层水琼脂,这样制作的平板即为双层平板,下层为含菌的无氮固体培养基,上层为不含 菌的水琼脂; 步骤三:将待检测的自生固氮菌点到步骤二制备的双层平板上,置30°C恒温箱培养2 至5天; 步骤四:结果检查,检查双层平板下层的指示菌是否有生长,如果发现指示菌出现生 长,则待检测自生固氮菌能分泌氨到细胞外,如果指示菌没有生长,则待检测的自生固氮菌 就不能分泌氨到细胞外。
[0011] 所述步骤二中水琼脂的制备方法为:1升蒸馏水加15克琼脂,121°C灭菌20分钟, 然后置50°C恒温箱保温备用。
[0012] 所述步骤二中指示菌为大肠杆菌,当然也可以用不能固氮的微生物。
[0013] 所述步骤二中指示菌原液的活菌浓度为2千万/毫升,指示菌原液指的是含有指 示菌的水溶液。
[0014] 为了避免残留的微量氮源对试验的影响,所述步骤一中K2HP04、MgS0 4* 7H20、 CaCl2 ? 2H20、葡萄糖、FeS04 ? 7H20、NaM〇04 ? 2H20均为分析纯,琼脂使用前需用蒸馏水洗。
[0015] 本发明所用的固体培养基是不含氮素营养的无氮固体培养基,不能自生固氮的细 菌不能在上面生长。具体方法是把不能固氮的细菌作为指示菌,如大肠杆菌,混在无氮固体 培养基中,然后将待测的自生固氮菌点到该无氮固体培养基上,观察自生固氮菌能够在无 氮培养基上生长。如果自生固氮菌能够把固定的氨分泌到胞外,那么该菌落周围的大肠杆 菌就能够生长,根据指示菌是否生长以及生长的多少可以判断自生固氮菌是否泌氨以及强 度。
[0016] 本发明的有益效果在于:本发明提供了一种无氮固体培养基及利用其鉴定自生固 氮菌是否分泌氨的方法。该方法简单易行,可以准确鉴定固氮菌是否分泌氮到胞外,以及分 泌能力大小,为生物肥料行业的发展起到重要作用。
[0017]
【附图说明】: 图1能够泌氨的自生固氮菌其菌落周围的指示菌生长图。
[0018]
【具体实施方式】: 为了便于本领域技术人员的理解,下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明, 实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
[0019] 实施例1。
[0020] -种无氮固体培养基,每升无氮固体培养基由以下原料组成: K2HP04 0 . 5g MgS04 ? 7H20 0. lg CaCl2 ? 2H20 0. 05g 葡萄糖 7g FeS04 ? 7H20 0. 005g NaMo04 ? 2H20 0. 005g 琼脂 l〇g 蒸馏水 余量。
[0021] -种利用无氮固体培养基鉴定自生固氮菌是否分泌氨的方法,它包括以下步骤: 步骤一:将配方量的 K2HP04、MgS04 ? 7H20、CaCl2 ? 2H20、葡萄糖、FeS04 ? 7H20、 NaM〇04 ? 2H20、琼脂和蒸馏水混合后搅拌均匀得到无氮固体培养基; 步骤二:制备双层平板,将步骤一得到的无氮固体培养基在118°C灭菌15分钟,待灭菌 后的无氮固体培养基温度降至46°C时加入指示菌,每100毫升无氮固体培养基加1毫升指 示菌,将加入指示菌的无氮固体培养基立即混匀倒入无菌培养皿,控制无氮固体培养基的 厚度在2. 2毫米,待无氮固体培养基凝固后再倒入厚度为0. 5毫米的一层水琼脂,这样制作 的平板即为双层平板,下层为含菌的无氮固体培养基,上层为不含菌的水琼脂; 步骤三:将待检测的自生固氮菌点到步骤二制备的双层平板上,置30°C恒温箱培养2 至5天; 步骤四:结果检查,检查双层平板下层的指示菌是否有生长,如果发现指示菌出现生 长,待检测自生固氮菌能分泌氨到细胞外。
[0022] 所述步骤二中水琼脂的制备方法为:1升蒸馏水加15克琼脂,121°C灭菌20分钟, 然后置50°C恒温箱保温备用。
[0023] 所述步骤二中指示菌为大肠杆菌。
[0024] 为了避免残留的微量氮源对试验的影响,所述步骤一中K2HP04、MgS0 4 ? 7H20、 CaCl2 ? 2H20、葡萄糖、FeS04 ? 7H20、NaM〇04 ? 2H20均为分析纯,琼脂使用前需用蒸馏水洗。
[0025] 实施例2。
[0026] -种无氮固体培养基,每升无氮固体培养基由以下原料组成: K2HP04 1 g MgS04 ? 7H20 0. 2g CaCl2 ? 2H20 0. lg 葡萄糖 l〇 g FeS04 ? 7H20 0.01 g NaMo04 ? 2H20 0.008 g 琼脂 15g 蒸馏水 余量。
[0027] -种利用无氮固体培养基鉴定自生固氮菌是否分泌氨的方法,它包括以下步骤: 步骤一:将配方量的K2HP04、MgS04 ? 7H20、CaCl2 ? 2H20、葡萄糖、FeS04 ? 7H20、 NaM〇04 ? 2H20、琼脂和蒸馏水混合后搅拌均匀得到无氮固体培养基; 步骤二:制备双层平板,将步骤一得到的无氮固体培养基在121°C灭菌20分钟,待灭菌 后的无氮固体培养基温度降至47°C时加入指示菌,每100毫升无氮固体培养基加1毫升指 示菌,将加入指示菌的无氮固体培养基立即混匀倒入无菌培养皿,控制无氮固体培养基的 厚度在2. 5毫米,待无氮固体培养基凝固后再倒入厚度为0. 8毫米的一层水琼脂,这样制作 的平板即为双层平板,下层为含菌的无氮固体培养基,上层为不含菌的水琼脂; 步骤三:将待检测的自生固氮菌点到步骤二制备的双层平板上,置30°C恒温箱培养2至5天; 步骤四:结果检查,检查双层平板下层的指示菌是否有生长,如果发现指示菌出现生 长,则待检测自生固氮菌能分泌氨。
[0028] 所述步骤二中水琼脂的制备方法为:1升蒸馏水加15克琼脂,121°C灭菌20分钟,
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