一种李辐射变异材料的早期鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于育种鉴定技术领域，具体涉及一种辐射育种材料早期鉴定的方法。
【背景技术】
[0002] 辐射诱变育种是指人为地利用一定剂量的物理射线照射植物材料诱发使其变异， 并经过人工选择、鉴定、培育新的品种。辐射诱变是培育果树新种质和新品种的有效途径。 果树辐射诱变育种可以提高果树基因突变频率，缩短育种年限，可以在短期内获得常规育 种难以获得的新种质。然而，在辐射育种过程中，仅有部分材料发生了变异。果树生长周期 较长，采用传统的植物学特征形态鉴定法和花粉显微电镜扫描法等方法进行变异材料的鉴 定较为困难。分子标记技术以其快速、高效、中性的特点在育种材料早期选择等方面日益显 示出重要作用。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种进行李辐射诱变材料早期鉴定的方法，加快李育种进 程，降低育种成本。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 1.叶片采集：采集李母树和辐射诱变植株的嫩叶。
[0005] 2.李叶片基因组DNA提取与检测：采用传统CTAB法或植物基因组DNA提取试剂 盒进行李叶片基因组DNA的提取。取5yL DNA溶液用1%的琼脂糖凝胶电泳进行DNA纯度 检测，电泳缓冲液为IX TAE Buffer，电泳20min后，凝胶用核酸染料进行染色，并用凝胶成 像系统仪进行凝胶图像采集。最后将各材料的DNA浓度稀释至40ng/ y L备用。
[0006] 3.卩0?反应体系屮0?11^1〇1^，引物0.8 1^，模板11^，水8.2 1^，总体积为 20yL。PCR反应程序为程序为：94°C预变性5 min;94°C变性30 s，50°C退火30 s，72°C延 伸1 min，35个循环；最后72°C延伸10 min。
[0007] 4.ISSR引物筛选：以部分材料的基因组DNA为模板，进行ISSR适宜引物筛选。
[0008] 5.李辐射诱变材料的ISSR分析：以筛选出的引物进行李辐射诱变材料DNA 的ISSR-PCR扩增。PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳进行分离，电泳缓冲液为1XTAE Buffer，电泳30min后，凝胶用核酸染料进行染色，并用凝胶成像系统仪进行凝胶图像采 集。
[0009] 6.凝胶图像分析：将辐射诱变李材料DNA扩增产物的电泳条带，与母树的条带逐 一进行比对。
[0010] 本发明的优点在于：本发明提供的方法可以对李辐射诱变材料进行早期鉴定，操 作方便，简单易行，成本低廉。无需通过长时间的表型观察，仅需取少量辐射诱变植株的叶 片，即可在早期将未发生的材料剔除，节约育种成本。
【附图说明】
[0011] 图1三月李及其突变体果实。其中A、B、C为三月李果实；D、E、F为突变体果实。 黑色粗线长度为lcm。
[0012] 图2 ISSR引物筛选电泳图谱，1 -22分别代表引物UBC811、UBC815、UBC816、 UBC821、UBC823、UBC825、UBC826、UBC827、UBC829、UBC836、UBC841、UBC842、UBC846、UBC847、 UBC848、UBC850、UBC853、UBC854、UBC855、UBC856、UBC857、UBC860 的扩增产物。
[0013] 图3三月李ISSR-PCR电泳图谱，1 :三月李；2 :红肉迟熟突变单株；3-7代表5个 表型未发生显著变异的辐射诱变的三月李材料。箭头表示存在差异的条带。
【具体实施方式】
[0014] 实施例1 1.叶片采集：采集三月李、辐射迟熟红肉突变体以及5个表型未发生显著变异的辐射 诱变的三月李材料的嫩叶。三月李母树及其突变体果实的性状如下图1。
[0015] 2.李叶片基因组DNA提取与检测：植物基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN，北京)进 行三月李叶片DNA提取。取5 y L DNA溶液用1%的琼脂糖凝胶电泳进行DNA纯度检测，电 泳缓冲液为1 XTAE Buffer，电泳20min后，凝胶用核酸染料进行染色，并用凝胶成像系统 仪进行凝胶图像采集。最后将各材料的DNA浓度稀释至40ng/ y L备用。
[0016] 3.PCR反应体系：商品化PCR mix 10 yL，引物0.8yL，模板lyL，水8.2yL，总 体积为20yL。PCR反应程序为程序为：94°C预变性5 min;94°C变性30 s，50°C退火30 s， 72°C延伸1 min，35个循环；最后72°C延伸10 min。
[0017] 4. ISSR 引物筛选： 根据前人的李ISSR研究结果，初步选择22条引物(表1)用于引物筛选。以三月李母树 的基因组DNA为模板，进行ISS R适宜引物筛选。如图2所示，经筛选共确定14条多态性好、 扩增条带清晰的引物（UBC811、UBC815、UBC816、UBC826、UBC827、UBC829、UBC836、UBC841、 UBC846、UBC847、UBC848、UBC855、UBC856、UBC857)，用于后续分析。
[0018] 表1三月李ISSR分析所用引物
5.李辐射诱变材料的ISSR分析：以筛选出的引物进行三月李、辐射迟熟红肉突变体以 及5个表型未发生显著变异的辐射诱变材料DNA的ISSR-PCR扩增。PCR扩增产物采用琼脂 糖凝胶电泳进行分离，电泳缓冲液为1 XTAE Buffer，电泳30min后，凝胶用核酸染料进行 染色，并用凝胶成像系统仪进行凝胶图像采集，结果见图3。
[0019] 6.凝胶图像分析：将辐射诱变李材料DNA扩增产物的电泳条带，与母树的条带逐 一进行比对。从图3可以看出，红肉突变体和母树的ISSR指纹图谱之间存在很大的差异，而 其他辐射诱变材料与母树的ISSR指纹图谱之间无明显差异。引物UBC811、UBC816、UBC826、 UBC829、UBC847、UBC855、UBC856和UBC857可将红肉突变体和母树区分开。
[0020] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 一种李辐射变异材料的早期鉴定方法，其特征在于：所述的方法包括叶片采集、李 叶片基因组DNA提取与检测、PCR反应体系、ISSR引物筛选、李辐射诱变材料的ISSR分析、 凝胶图像分析。2. 根据权利要求1所述的一种李辐射变异材料的早期鉴定方法，其特征在于：具体包 括以下步骤： 1) 叶片采集：采集李母树和辐射诱变植株的嫩叶； 2) 李叶片基因组DNA提取与检测：采用传统CTAB法或植物基因组DNA提取试剂盒进 行李叶片基因组DNA的提取，取5 y L DNA溶液用1%的琼脂糖凝胶电泳进行DNA纯度检测， 电泳缓冲液为I XTAE Buffer，电泳20min后，凝胶用核酸染料进行染色，并用凝胶成像系 统仪进行凝胶图像采集，最后将各材料的DNA浓度稀释至40ng/ y L备用； 3. PCR反应体系：PCR mix 10 yL，引物0. 8yL，模板lyL，水8. 2yL，总体积为20yL， PCR反应程序为程序为：94°C预变性5 min;94°C变性30 s，50°C退火30 s，72°C延伸I min， 35个循环；最后72°C延伸10 min ; 4. ISSR引物筛选：以部分材料的基因组DNA为模板，进行ISSR适宜引物筛选； 5) 李辐射诱变材料的ISSR分析：以筛选出的引物进行李辐射诱变材料DNA的 ISSR-PCR扩增，PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳进行分离，电泳缓冲液为IXTAE Buffer，电泳30min后，凝胶用核酸染料进行染色，并用凝胶成像仪进行凝胶图像采集； 6) 凝胶图像分析：将辐射诱变李材料DNA扩增产物的电泳条带，与母树的条带逐一进 行比对。
【专利摘要】本发明涉及一种辐射育种材料早期鉴定的方法，属于育种鉴定技术领域，所述的方法包括叶片采集、李叶片基因组DNA提取与检测、PCR反应体系、ISSR引物筛选、李辐射诱变材料的ISSR分析、凝胶图像分析。在辐射育种过程中，仅有部分材料发生了变异。果树生长周期较长，采用传统的植物学特征形态鉴定法和花粉显微电镜扫描法等方法进行变异材料的鉴定较为困难。本发明提供的方法可以对李辐射诱变材料进行早期鉴定，操作方便，简单易行。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105063197
【申请号】CN201510472545
【发明人】方智振, 叶新福, 周丹蓉, 潘少霖, 姜翠翠
【申请人】福建省农业科学院果树研究所
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月5日