检测空肠弯曲菌三种血清型的试剂盒的制作方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及PCR检测
技术领域：
，特别是涉及用于检测空肠弯曲菌血清型HS:7、HS:37、HS:21的特异性引物对组合和三重PCR检测方法，本发明还涉及同时检测空肠弯曲菌三种血清型的试剂盒。【
背景技术：
】[0002]空肠弯曲菌（Campylobacterjejuni)是弯曲菌属中主要导致人类疾病的食源性病原菌，是导致人类腹泻的主要病原之一。空肠弯曲菌分布广泛，人类感染主要是由于空肠弯曲菌污染食品、饮用水以及环境引起的，除肠炎外，空肠弯曲菌的感染可导致格林-巴利综合症（Guillian-Barresyndrome，简称GBS)，给人类带来严重的疾病负担。国内外对空肠弯曲菌的监测都非常关注。[0003]血清分型是空肠弯曲菌的生物分型方法之一，目前以热稳定抗原为基础的Penner血清分型（Pennerheat-stableserotype，HS)分析是空肠弯曲菌的主要分型方法。有研究发现，空肠弯曲菌感染后导致GBS的菌株与菌株的血清型有很大关系。某些特定血清型菌株感染后导致GBS的危险度大大增高。但是由于目前血清分型试剂匮乏、昂贵，实验步骤繁琐，需要有经验的专业人员操作，造成空肠弯曲菌血清分型的困难。因此迫切需要一种快速、准确、特异、灵敏地检测空肠弯曲菌血清型的方法。【
发明内容】[0004]本发明的目的在于提供用于同时检测空肠弯曲菌（Campylobacterjejuni)三种血清型HS:7，HS:37，HS:21的特异性引物对组合。[0005]本发明的另一个目的在于提供能够同时检测空肠弯曲菌HS:7，HS:37，HS:21血清型的试剂盒。[0006]为实现上述目的，本发明通过对决定菌株血清型的荚膜多糖（polysaccharidecapsule，简称CPS)合成相关基因簇的特异核苷酸序列的检测确定弯曲菌的血清型特征。对HS:7,HS:37,HS:21三种血清型空肠弯曲菌分别找出其共同的CPS合成基因簇相关DNA序列，以及区别于其它血清型的特异DNA序列，在NCBI上进行BLAST比对，确定筛选出这些序列针对上述三种血清型菌株的共同性以及特异性。通过比对，获得HS:7,HS:37,HS:21三种血清型菌株特有而其它血清型菌株中不存在的三段特异序列：HS:7血清型菌株特异性序列命名为SE-HS7-1，HS:37血清型菌株特异序列命名为SE-HS37-2,HS:21血清型菌株特异序列命名为SE-HS21-1，具体核苷酸序列分别如SEQIDN0.7-9所示。[0007]VectorNTISuite6比对已测序HS:7，HS:37，HS:21的CPS相关基因的特异序列一的保守性。并用primerpremier5,CloneManager8和Oligo7设计引物，引物设计避开序列的突变点，同时要考虑所设计的三对引物之间以及引物与靶序列之间不错配，不出现二级结构，并且三对引物扩增的目的片段的长度具有区别度，大小不能太接近。[0008]经过反复验证对比，最终确定用于检测空肠弯曲菌三种血清型的特异性引物对组合，分别为：[0009]用于检测血清型HS:7的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、2所示；[0010]用于检测血清型HS:37的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQIDNO.3、4所示；[0011]用于检测血清型HS:21的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQIDNO.5、6所示。[0012]进一步地，本发明提供了核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示的引物对在制备检测空肠弯曲菌血清型HS:7试剂盒或诊断试剂中的应用。[0013]本发明提供了核苷酸序列如SEQIDN0.3-4所示的引物对在制备检测空肠弯曲菌血清型HS:37试剂盒或诊断试剂中的应用。[0014]本发明提供了核苷酸序列如SEQIDN0.5-6所示的引物对在制备检测空肠弯曲菌血清型HS:21试剂盒或诊断试剂中的应用。[0015]在本发明的实施例中，使用序列如SEQIDN0.1-2所示的引物对空肠弯曲菌血清型HS:7采用PCR方法检测，反应条件为：94°C5min;94°Clmin，57°Clmin，72°Clmin，共30个循环；72°C8min，将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳，若目的条带为460bp，则说明待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:7。[0016]在本发明的实施例中，使用序列如SEQIDN0.3-4所示的引物对空肠弯曲菌血清型HS:37采用PCR方法检测，反应条件为：94°C5min;94°Clmin，57°Clmin，72°Clmin，共30个循环；72°C8min，将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳，若目的条带为550bp，则说明待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:37。[0017]在本发明的实施例中，使用序列如SEQIDN0.5-6所示的引物对空肠弯曲菌血清型HS:21采用PCR方法检测，反应条件为：94°C5min;94°Clmin，57°Clmin，72°Clmin，共30个循环；72°C8min，将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳，若目的条带为989bp，则说明待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:21。[0018]进一步地，本发明提供了核苷酸序列如SEQIDN0.7所述的靶序列在检测空肠弯曲菌血清型HS:7中的用途以及该靶序列在制备检测空肠弯曲菌血清型HS:7的试剂盒或试剂中的用途。[0019]SEQIDN0.7编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.10所示。[0020]进一步地，本发明提供了核苷酸序列如SEQIDNO.8所述的靶序列在检测空肠弯曲菌血清型HS:37中的用途以及该靶序列在制备检测空肠弯曲菌血清型HS:37的试剂盒或试剂中的用途。[0021]SEQIDN0.8编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.11所示。[0022]进一步地，本发明提供了核苷酸序列如SEQIDNO.9所述的靶序列在检测空肠弯曲菌血清型HS:21中的用途以及该靶序列在制备检测空肠弯曲菌血清型HS:21的试剂盒或试剂中的用途。[0023]SEQIDN0.9编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.12所示。[0024]本发明提供了含有上述3对特异性引物对的组合在制备检测空肠弯曲菌血清型试剂盒中的应用。[0025]本发明提供了含有上述特异性引物对组合的试剂盒。[0026]本发明的试剂盒是以上述针对3种血清型的特异性引物对组合为引物，以待测菌DNA为模板，进行三重PCR，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若电泳结果显示目的条带为460bp(如SEQIDN0.13所示），则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:7;若电泳结果显示目的条带为550bp(如SEQIDN0.14所示），则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:37;若电泳结果显示目的条带为989bp(如SEQIDN0.15所示）则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:21。[0027]优选地，本发明试剂盒的25y1PCR反应体系为，EasySuperMix12.5y1，ddH208.5y1，3对特异性引物对的上、下游引物均为0.5y1，浓度均为10yM，DNA模板1y1。[0028]优选地，本发明试剂盒的PCR的反应程序为：[0029]94°C预变性5min;[0030]94°C变性lmin，60°C退火lmin，72°Clmin，30个循环；[0031]72°C8min;4°C保持。[0032]本发明提供了一种非诊断目的的检测空肠弯曲菌三种血清型的方法，所述三种血清型为HS:7、HS:37和HS:21，同时使用3对特异性引物，通过一次PCR反应，对待测菌DNA进行检测，若将扩增产物大小为460bp，则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:7;若扩增产物大小为550bp，则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:37;若扩增产物大小为989bp，则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS:21;[0033]所述3对特异性引物分别为：[0034]用于检测血清型HS:7的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、2所示；[0035]用于检测血清型HS:37的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQIDNO.3、4所示；[0036]用于检测血清型HS:21的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQIDNO.5、6所示。[0037]当前第1页1 2 3