快速联检四种难培养鉴定细菌的多重定量pcr试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术，涉及一种快速联检四种难培养鉴定细菌的多重定量 PCR试剂盒，尤其涉及检测流感嗜血杆菌（Haemophilus Influenzae, HI)、肺炎链球菌 (Streptococcus Pneumoniae, SP)、卡他莫拉菌（Moraxella Catarrhalis, MC)、嗜肺军团菌 (Legionella Pneumophila, LP)的四重定量PCR试剂盒，具体地说，本发明涉及应用四重 定量PCR技术在一个PCR反应管中快速、平行地同时检测四种细菌（HI、SP、MC、LP)的试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 根据世界卫生组织（WHO)统计，肺炎是全球儿童的"头号杀手"，也是5岁以下儿童 死亡的第二位原因。在我国，儿童肺炎亦是儿童期重要的常见疾病，在儿童患病率、病死率 中占据第一，用于治疗肺炎的巨大医疗费用加重了社会和患儿家庭的经济负担。近年来随 着抗生素、激素及免疫抑制剂的广泛应用，呼吸道防御功能及机体免疫力降低，人体寄生菌 与宿主之间的关系发生了变化，同时耐药菌的出现也进一步加重了疾病负担。
[0003] 分析研究显示中国5岁以下死于肺炎的儿童中，感染肺炎链球菌和b型流感嗜血 杆菌的占到54. 2%。肺炎链球菌（SP)和流感嗜血杆菌（HI)常与正常菌群共生，是儿童社区 获得性肺炎的重要致病菌，通常起病急骤，以高热、寒战、咳嗽、血痰及胸痛为特征，主要经 呼吸道传播，好发于冬春季。卡他莫拉菌（MC)是引起儿童肺炎的第三位常见致病菌，仅次于 前两者，其发病率有逐年增加趋势，且令人担忧的是已发现产内酰胺酶菌株占分离菌 90%以上，给临床治疗带来困难。MC产生的内酰胺酶不仅保护着细菌产生的各种致病 性的酶，而且使得其他严重呼吸道合并感染如SP、HI感染对青霉素治疗无效。嗜肺军团菌 (LP)感染引起的肺炎，其临床表现多样，X线胸片改变缺乏特异性，可能合并肺外多脏器损 害。军团菌肺炎在非典型肺炎中是病情最严重的一种，未经有效治疗者的病死率高达45%。 以上四种细菌感染引起的肺炎，其症状、体征及X线检查结果不易鉴别和鉴定，因此快速同 步对小儿细菌性肺炎四种临床难鉴定病原体（!11、5?、1?：、1^)进行联合检测及鉴别诊断意义 重大。
[0004] 细菌性肺炎的临床表现复杂多样、不典型，容易误诊和漏诊，为了早期明确病因诊 断，及早采取快速、有效的治疗，一个敏感而可靠的实验室诊断技术是必需的。HI、SP、MC、 LP感染引起的肺炎临床对其病原学诊断主要依靠细菌学检查。痰细菌培养仍是常规检测项 目，细菌培养阳性是诊断的金标准，具有一定的临床价值，但其生长缓慢、培养耗时长，技术 要求高，从临床样本中进行分离培养较困难并且难鉴定，易混淆而造成误诊，尤其在混合感 染中，可能会忽视一些潜在的病原菌，因而限制了其在临床的应用。另外，虽然血清学方法 技术成熟，有商品试剂盒供应，但是敏感性和特异性有待提高，同时，需要检测急性期和恢 复期双份血清才有诊断意义且容易漏诊。
[0005] 定量PCR检测方法是目前众多研究的焦点，优点是快速简便、准确可靠、敏感性 高、特异性强、可以定量、不受抗生素应用的影响等。由此基础上发展而来的多重定量PCR 在儿童肺炎病原体联合检测及鉴别诊断中变得越来越重要。因此，迫切需要单管PCR同时 定量检测以上4种临床难培养鉴定细菌的感染或混合感染的试剂盒。其不仅快速准确、节 约成本，还可根据细菌感染的滴度，为小儿肺炎患者提供早期明确诊断和防治，为临床治疗 方案的制定提供参考依据，从而提高临床决策水平，有效降低抗生素的过度使用，监测临床 疗效，并最终改善患者预后。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种快速联检四种难培养鉴定细菌 的多重定量PCR试剂盒，由DNA提取液、四重荧光PCR反应液、1个阴性质控品、1个强阳性 质控品、1个弱阳性质控品、5个浓度的阳性定量标准品组成。其中四重荧光PCR反应液为 四组引物、探针以及qPCR反应缓冲液(含Mg2+)、四种dNTP、HotStartTaqDNA聚合酶等成 分构成的混合液。阴性质控品为灭菌注射用水。强、弱阳性质控品为由流感嗜血杆菌（HI)、 肺炎链球菌（SP)、卡他莫拉菌（MC)和嗜肺军团菌（LP)等量混合的阳性质粒样品，强阳性 质控品浓度l〇7Copies/y1，弱阳性质控品浓度103Copies/y1。5个阳性定量标准品是由 HI、SP、MC、LP等量混合的质粒样品，浓度分别为 103Copies/yl、104Copies/yl、105Copies/ y1、106Copies/y1、107Copies/y1。引物探针需要放置棕色瓶中避光。
[0007] 所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列、标准品序列如下： HI： 上游引物：GATGCTGGTGTAITTGGTGG下游引物：CCGITCAACTTGGGCTTTAG 探针：SAT-AGTGGTGCTTATCGAGTAACAGAAG-SAT SP： 上游引物：CAITTGGTGATGCGGCTA下游引物：AGGACGGCTITCGITGAG 探针：MAR-CCGGTGCAGATATTGTTTACCAAGT-MAR MC： 上游引物：ATCTATGCCAACTGGAAGCC下游引物：CCAACACGGAAATCACGAC 探针：JUP-CTATCGCCCACACACTCAGCGTG-JUP LP： 上游引物：TCGTCACTTAAACGGCTTC 下游引物：TACCGACCAGGAITGCTAC 探针：NEP-CGTACCGGCCTTGATATGAATTATG-NEP SAT、MAR、JUP、NEP是AllGlo探针的四种不同荧光素。
[0008] HI标准品序列： GATGCTGGTGTATTTGGTGGAAAAACTGACTTGAGTGCTATCAACTTAAATTTAAGTGGT GCTTATCGAGTAACAGAAGGTTTGAGCCTAGGTTTAGGGGTAAATGCGGTTTATGCTAAAGCCCAAGTTG AACGG SP标准品序列： CATTTGGTGA TGCGGCTAAA GGTAAAACAA TTGCAGCCGC ACAATACGCA GCCGGTGCAG ATATTGTTTA CCAAGTAGCT GGTGGTACAG GTGCAGGTGT CTTTGCAGAG GCAAAATCTC TCAACGAAAG CCGTCCT MC标准品序列： ATCTATGCCA ACTGGAAGCC TTATGGCAAT GATAAGGTGA ATGTAAACTT TGCGGTGAAT AATGTCTTTA ATAAAAACTA TCGCCCACAC ACTCAGCGTG CTTCCATAGA TACCTTACCT GGGGCAGGTC GTGATTTCCG TGTTGG LP标准品序列： TCGTCACTTA AACGGCTTCT TTCTAGATAA CTTCAATTCC AAATTCAATG GATTTGGTCC CCGTACCGGC CTTGATATGA ATTATGTATT CGGTAATGGG TTTGGTATTT ATGCAAAATC AGCTGTAGCA ATCCTGGTCG GTA 本发明四种难培养鉴定细菌的多重定量PCR试剂盒的检测方法包括如下步骤： (1) 引物设计：在GenBank中检索获得流感嗜血杆菌（Haemophilus Influenzae, HI)、 肺炎链球菌（Streptococcus Pneumoniae, SP)、卡他莫拉菌（Moraxella Catarrhalis,MC)、 嗜肺军团菌（Legionella Pneumophila, LP)特异性的保守基因，通过序列比对，确定它们 各自的高度保守序列区，作为四种细菌的待检靶基因特异性核酸序列分别设计特异引物； (2) 荧光探针设计：根据步骤（1)中的四种细菌的待检靶基因特异性核酸序列设计荧 光探针； (3) 标准品和和质控品的构建：根据步骤（1)确定的特异引物，利用基因克隆技术构建 四种分别含有HI、SP、MC、LP高度保守序列区的标准质粒分子； (4) 四重定量PCR反应体系的优化与建立：使用步骤（1)中的引物和步骤（2)中的探针 及qPCR反应缓冲液(含Mg2+)、四种核苷酸单体（dNTPs)、HotStartTaqDNA聚合酶等成分 组成四重荧光PCR反应液，通过100-400nM范围内各个浓度的引物和探针的组合，优化四重 定量PCR反应体系，根据反应效率和曲线确定最终的PCR反应体系； (5 )标准曲线制备：使用步骤（4 )中的四重荧光PCR反应体系，将已知拷贝数的含有HI、 SP、MC、LP目的扩增片段的重组质粒连续10倍倍比稀释，加入到四重定量PCR主反应液中， 综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值和基线，进行结果分析，制备标准曲线； (6)临床验证：用HI、SP、MC、LP临床标本细菌DNA提取液作为模板，进一步用步骤（4) 和（5)的方法和条件进行四重定量PCR扩增；