免疫原性多肽表层表达双歧杆菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫原性多肽表层表达双歧杆菌，更详细而言，例如，涉及能够制造丙 型肝炎疫苗组合物的免疫原性多肽表层表达双歧杆菌。
【背景技术】
[0002] 丙型肝炎病毒（HCV)的携带者在世界中有1亿7000万人以上，约70%暴露于转变 为慢性肝炎、肝硬化、肝癌的风险中。在日本也存在约200万人的携带者，其中约80%为lb 型感染。
[0003] 作为丙型肝炎的治疗，主要进行干扰素治疗。但是，采用组合了聚乙二醇干扰素 a与抗病毒药利巴韦林的并用疗法，1型病毒排除率为50%以下，并且治疗期间长，副作用 大，因此，需要更有效的治疗药的开发和治疗法的建立。
[0004] HCV是属于黄病毒科的正链RNA病毒，包括4种结构蛋白区域（C-E1-E2-P7)和6 种非结构蛋白区域（NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B)。其中，NS3蛋白在N末端侧的三分之 一具有丝氨酸蛋白酶活性，C末端侧的三分之二具有RNA解旋酶活性。对于这样的具有蛋 白酶-解旋酶的2种活性的NS3蛋白，为了解明立体结构，通过X射线结晶解析研究了其立 体结构（非专利文献1)。
[0005] HCV感染被治愈的患者中，可见NS3特异性强免疫应答（非专利文献2)。另外，NS3 蛋白在遗传学上的保守性高，鉴定出大量细胞毒性T细胞（CTL)表位（非专利文献3)。
[0006] 报告了用于丙型肝炎的预防或治疗的源自NS3蛋白的多肽的利用。例如，在专利 文献1中，记载了含有源自HCV的NS3区域的氨基酸1188~1463位的至少8个氨基酸连 续的氨基酸或由其构成并含有T细胞刺激性表位的多肽。在专利文献2中，记载了将表达 含有与HCV核序列的至少一部分连结的HCV NS3蛋白酶的至少一部分的HCV融合蛋白的酵 母细胞作为疫苗的基础。在专利文献3,记载了将表达NS3等的全长蛋白质或免疫原性蛋白 质、分泌的弱毒化单核细胞增多性李司或菌（Listeria monocytogenes)等细菌作为疫苗平 台。
[0007] 另一方面，着眼于将通过基因重组得到的转化微生物作为口服疫苗使用的方法。 报告了对小鼠口服给药转化长双歧杆菌（Bifidobacterium longum)，该转化长双歧杆菌使 用存在于双歧杆菌属微生物（本说明书中，也称为"双歧杆菌"）的细胞膜的GNB/LNB基质 结合膜蛋白（本说明书中，也称为"GLBP"）在表层表达源自鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium)的鞭毛蛋白（flagellin)，由此，在血中产生鞭毛蛋白特异性抗体，通过肠道 粘膜免疫而诱导全身性免疫，从而有效抑制鼠伤寒沙门氏菌的经口感染引起的小鼠的致死 作用（非专利文献4和专利文献4)。另外，还报道了由含有转化长双歧杆菌的耐酸性胶囊 制剂构成的口服疫苗，该转化长双歧杆菌在细胞内或分泌表达源自鼠伤寒沙门氏菌、霍乱 弧菌（Vibrio cholerae)或痢疾志贺菌（Shigella dysenteriae)的鞭毛蛋白（专利文献 5) 〇
[0008] 现有技术文献
[0009] 专利文献
[0010] 专利文献1 :日本特表平9-504534号公报
[0011] 专利文献2 :日本特表2008-516610号公报
[0012] 专利文献3:日本特表2011-529077号公报
[0013] 专利文献4:国际公开第2011/034181号
[0014] 专利文献5:国际公开第2008/114889号
[0015] 非专利文献
[0016] 非专利文献 1 :Structure，7 卷，1353-1363 页，1999 年
[0017]非专利文献 2 :J. Gene. Med.，10 卷，177-186 页，2008 年
[0018]非专利文献 3 :J. Clin.Invest.，95 卷，521-530 页，1995 年
[0019]非专利文献 4 :Vaccine，28 卷，6684-6691 页，2010 年
【发明内容】
[0020] 发明所要解决的课题
[0021] 本发明的目的在于提供一种用于HCV感染的治疗的更有效的治疗药。本发明的目 的还在与提供一种通过口服给药对HCV感染引起的疾患的治疗有效的治疗药。本发明的目 的还在于提供一种用于在双歧杆菌的表层表达免疫原性多肽的方法。
[0022] 用于解决课题的方法
[0023] 本发明的发明人着眼于作为HCV复制相关区域的非结构蛋白3(non-structural protein 3 :NS3)的免疫原性，设计含有源自NS3蛋白的CD4表位和CD8表位的合成多肽， 由此，成功地制作了在表层表达和提呈HCV抗原多肽的双歧杆菌，并且在将该HCV抗原多肽 表层表达双歧杆菌口服给药的动物中成功地诱导了 NS3特异性免疫应答（即，NS3特异性 肠道粘膜免疫与全身性体液免疫、以及细胞免疫的诱导）。并且发现，通过应用这样的合成 多肽的设计，能够提供对于免疫原性多肽可广泛利用的双歧杆菌表层表达基因。
[0024] 本发明提供一种用于在双歧杆菌的表层表达免疫原性多肽的双歧杆菌表层表达 基因，其中，
[0025] 该基因含有编码该免疫原性多肽的基因，
[0026] 该免疫原性多肽为含有基础结构域（base domain)和至少一个抗原肽的丙型肝炎 病毒抗原多肽，
[0027] 该基础结构域含有选自下述（1)~（4)的多肽中的一个以上，
[0028] (1)含有序列号16的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90%的 序列同一性的氨基酸序列的多肽；
[0029] (2)含有序列号17的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90%的 序列同一性的氨基酸序列的多肽；
[0030] (3)含有序列号18的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90%的 序列同一性的氨基酸序列的多肽；和
[0031] (4)含有序列号19的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90%的 序列同一性的氨基酸序列的多肽；
[0032] 该抗原肽为选自含有序列号4~15的氨基酸序列的肽以及含有与序列号4~15 的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的肽的至少一种，
[0033] 该至少一个抗原肽与该基础结构域的N末端侧和C末端侧的任一侧连结。
[0034] 在一个实施方式中：
[0035] (1)上述基础结构域为含有序列号16的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸 序列具有至少90 %的序列同一性的氣基酸序列的多妝，在该基础结构域的N末端侧连 结包含QSFLATCINGVCWTVYHGAG (序列号4)或含有与该氨基酸序列具有至少90 %的序 列同一性的氨基酸序列的肽的区域，在C末端侧连结包含EIPFYGKAI (序列号7)或含有 与该氨基酸序列具有至少90 %的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域、或者连接包含 EIPFYGKAI (序列号7)或含有与该氨基酸序列具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的 肽、KLSALGVNA(序列号9)或含有与该氨基酸序列具有至少90%的序列同一性的氨基酸序 列的肽、和VATDALMTGYTCDFDSVIDC(序列号10)或含有与该氨基酸序列具有至少90%的序 列同一性的氨基酸序列的肽的区域；
[0036] (2)上述基础结构域为含有序列号17的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序 列具有至少90 %的序列同一性的氣基酸序列的多妝，在该基础结构域的N末端侧连结包 含〇5?1^1'(：1如￥0117￥1?46(序列号4)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90%的序列同 一性的氨基酸序列的肽的区域，在C末端侧连结包含含有EIPFYGKAI (序列号7)的肽或含 有与该氨基酸序列具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的肽、含有KLSALGVNA(序列 号9)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的肽、和含有 VATDALMTGYTCDFDSVIDC(序列号10)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90%的序列同一 性的氨基酸序列的肽的区域；
[0037] (3)上述基础结构域为含有序列号18的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序 列具有至少90 %的序列同一性的氣基酸序列的多妝，在该基础结构域的N末端侧连结包含 含有〇3?1^1'(：1如￥0117￥1?46(序列号4)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90%的序列 同一性的氨基酸序列的肽的区域，在C末端侧连结包含含有TPAETSVRLRAYLNTPG(序列号 15)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域；或
[0038] (4)上述基础结构域包含含有序列号19的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸 序列具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的多肽，在C末端侧连接包含含有序列号16 的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的 多肽、含有EIPFYGKAI(序列号7)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90%的序列同一性 的氨基酸序列的肽、含有KLSALGVNA(序列号9)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90% 的序列同一性的氨基酸序列的肽、和含有VATDALMTGYTCDFDSVIDC(序列号10)的肽或含有 与该氨基酸序列具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域。
[0039] 在一个实施方式中，上述双歧杆菌表层表达基因还含有编码源自双歧杆菌的GNB/ LNB基质结合膜蛋白的基因，编码上述免疫原性多肽的基因位于该源自双歧杆菌的GNB/ LNB基质结合膜蛋白的3 '末端侧。
[0040] 本发明还提供一种基因表达用质粒，其以能够表达上述双歧杆菌表层表达基因的 方式含有该基因。
[0041] 本发明还提供一种转化双歧杆菌，其保持上述的质粒，在细胞表层提呈上述免疫 原性多肽。
[0042] 本发明还提供一种转化双歧杆菌，其在基因组中以能够表达上述双歧杆菌表层表 达基因的方式含有该基因，在细胞表层提呈上述免疫原性多肽。
[0043] 本发明还提供一种丙型肝炎疫苗组合物，其含有在细胞表层提呈上述丙型肝炎病 毒抗原多肽的转化双歧杆菌。
[0044] 在一个实施方式中，上述疫苗组合物为口服疫苗。
[0045] 本发明还提供一种设计用于在双歧杆菌的表层表达的免疫原性多肽的方法，该方 法包括：
[0046] 选择保持立体结构并且具有细胞分泌能力的基础结构域和至少一个抗原肽的工 序；以及
[0047] 设计将该至少一个抗原肽与该基础结构域的N末端侧和C末端侧的任一侧连结的 合成多肽的工序。
[0048] 在一个实施方式中，上述基础结构域含有至少一个⑶4表位或⑶8表位或者含有 其双方。
[0049] 本发明还提供一种转化双歧杆菌，其在细胞表层表达在癌细胞的表层特异性表达 的多肽。
[0050] 在一个实施方式中，上述转化双歧杆菌还含有编码源自双歧杆菌的GNB/LNB基质 结合膜蛋白的基因。
[0051 ] 本发明还提供含有上述转化双歧杆菌的癌疫苗。
[0052] 发明的效果
[0053] 根据本发明，能够在双歧杆菌的细胞表层表达和提呈免疫原性多肽。另外，根据本 发明，例如，在将在双歧杆菌的表层提呈免疫原性的丙型肝炎病毒抗原多肽的双歧杆菌口 服给药的动物中，能够诱导对丙型肝炎病毒抗原特异性的免疫，因此，能够作为疫苗组合物 (例如，口服疫苗）利用。
【附图说明】
[0054] 图1表示含有HCV-lb型的多肽（GenBank :BAA08120. 1)的NS3蛋白全长区域的氨 基酸序列。
[0055] 图2表示作为合成NS3多肽的例子的氨基酸序列1和2,该合成NS3多肽中，基于 HCV-lb型多肽的NS3的接头部位和N末端侧的0 - a - 0结构域，将源自NS3的抗原肽与基 础结构域的N末端和C末端连结。
[0056] 图3是对野生型长双歧杆菌245、长双歧杆菌2164和长双歧杆菌2165中的合成 NS3蛋白的表达的蛋白质印记（蛋白质印记）的结果的照片。
[0057] 图4表示长双歧杆菌245 (1、4)、长双歧杆菌2164 (2、5)和长双歧杆菌2165 (3、6) 的亮视野显微镜照片（1~3)和荧光显微镜照片（4~6)。
[0058] 图5是表示包括长双歧杆菌2164给药组和长双歧杆菌2165给药组的各种给药组 的小鼠粪便中所含的NS3抗原特异性IgA抗体的经日变化的图表。
[0059] 图6是表示包括长双歧杆菌2164给药组和长双歧杆菌2165给药组的各种给药组 的小鼠血清中所含的NS3抗原特异性IgG抗体的经日变化的图表。
[0060] 图7是表示包括长双歧杆菌2164给药组和长双歧杆菌2165给药组的各种给药组 的小鼠脾脏细胞中根据有无NS3抗原刺激而进行的IFN-y量的比较的图表。
[0061] 图8表示作为合成NS3多肽的一例的氨基酸序列，该合成NS3多肽中，基于HCV-lb 型多肽的NS3的a -螺旋结构域，将源自NS3的抗原肽与基础结构域的N末端和C末端连 结。
[0062] 图9表示作为合成NS3多肽的一例的氨基酸序列，该合成NS3多肽中，基于HCV-lb 型多肽的NS3的C末端侧0 - a - 0 -结构域，将源自NS3的抗原肽与基础结构域的N末端 和C末端连结。
[0063] 图10表示作为合成NS3多肽的一例的氨基酸序列，该合成NS3多肽中，基于在N 末端连结了 HCV-lb型多肽的NS4A区域的一部分的NS3的折叠桶（-barrel)结构域， 将源自NS3的抗原肽与基础结构域的N末端和C末端连结。
[0064]图 11 表示质粒 pBApo_CMVNeo/NS3/4A 的构建。
[0065] 图12表示通过RT-PCR检测NS3/4A片段。
[0066] 图13表示通过蛋白质印记检测NS3/4A。
[0067] 图14表示NS3表达双歧杆菌疫苗对表达NS3/4A的EL4细胞的增殖抑制的效果。
【具体实施方式】
[0068](双歧杆菌）
[0069] 本发明中，"双歧杆菌"是指属于双歧杆菌属的微生物。作为双歧杆菌，例如，可 以列举青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis)、角双歧杆菌（B.angulatum)、动 物双歧杆菌动物亚种（B.animalis subsp.anim