精氨酸果糖苷(af)制备方法及其医用用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及精氨酸衍生物类的化合物，具体的说是精氨酸果糖苷，并公开了该化 合物在医疗领域的新用途。
【背景技术】
[0002] 糖尿病（diabetesmellitus)是一种体内胰岛素相对或绝对不足或革E细胞对胰 岛素敏感性降低或胰岛素本身存在结构上的缺陷而引起的碳水化合物、脂肪和蛋白质代 谢紊乱的一种慢性疾病。它不是单一的疾病，而是复合病因引起的综合征，是包括遗传及 环境因素在内的多种因素共同作用的结果。亚洲糖尿病学会披露，截至2012年中国患糖 尿病的总人数已达到9240万，其糖尿病发病率高达9. 7%。糖尿病患者平均可减少十年寿 命，且可能发生的并发症遍及全身。视网膜症、肾病和神经障碍的发病率最高，被称为糖尿 病的三大并发症。目前，糖尿病的分类主要有四类：1型糖尿病又称为胰岛素依赖性糖尿 病（insulin-dependentdiabetesmellitus)、2型糖尿病又称为非胰岛素依赖性糖尿病 (non-insulin-dependentdiabetesmellitus)、妊娠糖尿病及其他特殊类型的糖尿病。在 糖尿病的患者中，2型糖尿病所占的比例约为95%。它是成人发病型糖尿病，多在于35-40 岁之后发病，但是现在青年发病率明显增多。目前，我国20岁以上人群中男性和女性糖尿 病的患病率分别达10. 6%和8. 8%。
[0003] 精氨酸单糖苷(AF)，又称为精氨酸果糖苷，其化学名为1-(精氨酸_N°基）_1_去 氧-D果糖。它是人参加工过程中的初产物，是由鲜人参中的葡萄糖与精氨酸经加热后发 生美拉德反应所生成的。1996年研究者报告 [1]，从红参中分离并鉴定了该化合物，并进行 了化学合成，其简单合成路线：精氨酸与葡萄糖的比例为1:2,在溶媒冰醋酸的条件下，温 度80°C下反应1小时，即可获得AF合成物。2009年LeeJung-Sook等[2]报告了AF体外 抗氧化作用；2009年Jang,HaeDong[3]报告，精氨酸衍生物制备及改善男性性功能；JP 2010090076[4]公开了AFG与AF的制造方法及其在化妆品中的应用；KR10-0966613?专 利指出，采用发酵法制备精氨酸衍生物，并应用健康大鼠观察了AFG与AF对餐后血糖的 作用，AFG与AF有降低餐后血糖的作用，但是没有观察AF对2型糖尿病大鼠或小鼠的空腹 血糖以及餐后血糖的作用，CN102178687?公开了AFG对2型糖尿病大鼠的治疗作用，可明 显降低大鼠空腹血糖，餐后血糖以及血液生化指标。本发明以链脲佐菌素（STZ)诱导2型 糖尿病动物模型，观察AF对2型糖尿病小鼠的作用，发现AF在糖尿病的治疗方面具有很好 的疗效。因此，AF在作为预防和治疗糖尿病药物方面有着可观的开发和应用价值。
[0004] 众所周知饮酒过量会造成各种肝脏疾病。饮酒量与肝硬化的发病率存在一定的联 系 [7]。Mandayamw等调查发现，如果男人平均每日摄入乙醇量超过80g，女人平均每日摄入 乙醇量超过20g，以此方式饮酒达10年以上者，其患肝硬化的几率会大大增加。每日饮酒超 过30g的人与不饮酒的相比肝硬化的几率要大10%左右[9]。此外，一次性大剂量的饮酒也 会增加酒精性肝病的发病率[1°'11]。酒的类别对酒精性肝病的影响在于烈酒更容易造成肝损 伤，调查发现，白酒和啤酒比葡萄酒更容易损伤肝脏 [12]。另有报道指出在进餐时间以外饮 酒的患酒精性肝病的风险比进餐时饮酒的要高2. 7倍[13]。与男人相比，女人的肝脏更容易 收到酒精的伤害，因女性肝脏对酒精的敏感程度高，导致肝损伤所需的酒精量比男性要少 [14]。此外，蛋白质及一些微量营养元素的缺失，也会增加酒精对肝脏的损伤程度 [15]。就个 体差异而言，遗传对酒精的代谢起到很大的影响，因酒精在肝脏中代谢需要酶的参与，遗传 是造成个体间酒精代谢酶含量多少的主要原因 [lfU7]。这也就说同等剂量的酒精，对不同人 造成的损伤的是有差异的，也解释了为什么喝一样多的酒，有人没事，有的人就会喝醉。黄 种人的乙醇脱氢酶就有异于白种人，其活性较低，所以其酒精性肝病患病率较西方人低。对 已感染肝炎病毒的患者，饮酒会增加肝硬化的风险 [18]，患有酒精性肝病的患者一旦感染上 肝炎病毒，也会加重酒精性肝损伤的程度[19]。乙醇进入肝脏时破坏了肝细胞膜脂质双分子 层，改变了包膜的通透性，从而影响了其结构和功能。大量的乙醇迅速损害可以帮助人体吸 收脂肪的甲基供体，从而使脂肪在肝脏积蓄，造成肝脏损伤 [2°]。乙醇还能造成体内半胱氨 酸积蓄，损伤内质网，破坏线粒体功能紊乱。线粒体功能的紊乱就大大降低了氧化乙醛的能 力，进而使毒性更强的乙醇代谢中间产物一乙醛在肝脏内的含量增加。它与体内多种蛋白 共价结合，形成不稳定的乙醛蛋白加合物 [21]，不但破坏原有蛋白质结构与功能，而且还会 刺激机体产生抗体，引起免疫应答，对肝细胞造成伤害[22]。
[0005] 酒精性肝病是一类危害大但又不易察觉的疾病，临床表现主要包括酒精性脂肪 肝，酒精性肝炎，酒精性肝硬化三类。若不及时治疗，任其发展，可发生很多并发症，严重者 会导致肝癌。近十年来，随着人们生活水平的不断提高和社交圈的扩大，全球酒的消费量也 在迅速递增。同时，酒精性肝病的病发率也呈明显上升趋势。对于肝脏疾病的治疗，选择合 适的药物十分关键，可以很大程度上避免因药物对肝脏造成的二次伤害，应当选择毒副作 用小的天然保肝药物。目前市场上使用的保肝药物有许多，联苯双酯是目前运用较为普遍 的一种，另外从中药中提取的水飞蓟素也收到很好的效果。本专利公开了AF对酒精肝损伤 的修复作用。
[0006] 经检索未见关于AF在抗2型糖尿病及酒精肝损伤的修复作用的报道。
【发明内容】
[0007] 本发明涉及精氨酸单糖苷（AF)在治疗2型糖尿病及酒精肝损伤修复作用的新用 途。本发明所使用的化合物：1_ (精氨酸4°基）_1_去氧-D果糖，简称AF，其化学结构 是如下：
本发明所使用的AF具体制备方法：将L-精氨酸与葡萄糖以1:2-4的质量比，置入2-8 倍量的冰醋酸中，待二者充分溶解后，在温度60-80°C的条件下反应10-60分钟，反应完成 后，在40°C以下条件下除去醋酸，冷冻干燥，即得AF总合成物。将AF总合成物用硅胶干法 拌样，过200-300目硅胶湿柱，70%乙醇洗脱，收集AF流份，真空低压浓缩，回收乙醇，冷冻 干燥成粉末。将粉末溶于1-8倍量的0. 2%的醋酸三重蒸馏水中，上聚丙烯酰胺凝胶柱，以 0. 2%的醋酸水溶液洗脱，再次收集AF流份，冷冻干燥即得AF纯品。
[0008] 以下实验表明本发明提供的1、AF的制备及检测方法；2、AF在治疗2型糖尿病；3、 酒精肝损伤的修复作用。
[0009] 实验例IAF合成方法 将L-精氨酸与葡萄糖以1:2-4的质量比，置入4倍量的冰醋酸中，待二者充分溶解后， 在温度80°C的条件下反应30分钟，反应完成后，在40°C以下条件下除去醋酸，冷冻干燥，即 得AF粗合成物。将AF粗合成物用硅胶干法拌样，过200-300目硅胶湿柱，70%乙醇洗脱，收 集AF流份，真空低压浓缩，回收乙醇，冷冻干燥成粉末。将粗合成物粉末溶于少量的0. 2% 的醋酸三重蒸馏水中，使其浓度达到〇. 6g/mL，然后上聚丙烯酰胺凝胶柱，以0. 2%的醋酸水 溶液洗脱，再次收集AF流份，冷冻干燥即得AF纯品。
[0010] 实验例2AF测试方法 a)精密称取AF样品I. 5mg，用蒸馏水溶解，使之浓度为I. 5mg/mL，0. 23ii滤膜过滤样 品，HPLC分析备用。
[0011] b)HPLC分析条件：流动相A:醋酸钠缓冲溶液（pH6. 5)-乙腈溶液；流动相B: 乙腈-水（体积比为4:1)溶液。线性梯度洗脱：0min，0%B;4min，3%B;16min，10%B;流速 I.OmL/min。检测波长254nm;柱温40°C;色谱柱Vnusil-AA氨基酸分析专用柱（5iim， 4. 8mmX250mm);液相色谱分析仪为岛津LC-20A。
[0012] c)HPLC流动相溶液的配置 流动相A的配制方法：称取7. 6g醋酸钠，加三重水925mL，溶解后用冰醋酸调pH至 6. 5,然后加乙腈70mL，混匀，用0. 45iim滤膜过滤； 三乙胺、乙腈溶液：取三乙胺1瓶（I. 4mL)，加乙腈8. 6ml，混匀； 异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯1瓶（25iU)，加乙腈2mL，混匀，4°C保存。
[0013] e)待测样品及标准品溶液的衍生 准确吸取精氨酸标准溶液、AF样品溶液200iiL，置于2ml离心管中，再加入三乙胺乙腈 溶液100yL，异硫氰酸苯酯乙腈溶液100iU，混匀，室温放置lh，然后加入正己烷400iiL， 振摇后放置lOmin，取下层溶液，0. 45ym滤膜过滤，带进行液相分析。
[0014] f)将AF样品溶液和精氨酸标准品溶液进行液相分析，进样量为20iil，根据峰面 积归一化法计算得到样品AF的纯度为96. 7%。
[0015] 实验例3精氨酸单糖苷（AF)对2型糖尿病的作用 1.实验材料、动物、仪器及试剂 动物系昆明种小鼠，体重20-22g，雄性，购自于吉林大学基础医学院实验动物中心。
[0016] f5D血糖试剂盒，北京怡成电子技术有限公司；BP211D型电子天平(十万分之一)， 德国sartorius公司离心机，上海东方仪器厂；酶标仪，日本三洋公司；酸度计，上海虹易科 技公司；。
[0017] 精氨酸单糖苷（AF):纯度96. 7%，4°C保存，由实验室自制，用前用蒸馏水配制成所 需浓度。
[0018] 链脲佐菌素（STZ)，sigma公司；葡萄糖，上海三浦化工有限公司；二甲双胍，北京 京丰制药有限公司；生理盐水，长春豪邦药业有限公司；基础饲料，吉林大学基础医学院实 验动物