抗菌肽的分级二次超滤纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及抗菌肽的纯化方法，具体涉及抗菌肽的分级二次超滤纯化方法。
【背景技术】
[0002]无论宿主是低等动物还是高等动物，微生物都必须克服宿主的天然免疫或获得性免疫防御机制才能生存。在宿主天然免疫防御机制中，多种细胞产生的抗菌因子发挥重要作用。天然免疫的所有效应因子均为多肽或小分子量蛋白，其中抗菌肽(antibacterialpeptides，ABP)是天然免疫的主要效应分子，是动物机体具有天然免疫力的重要原因。
[0003]1972年，Boman等发现果绳(Drosophila)经诱导可产生有抗菌作用的蛋白。1981年，Steiner、Boman等在惜古比天蚕(Hyalophora cecropia)中分离并命名了第一个昆虫抗菌肽一cecropins (杀菌肽)。同年，Patterson-Delaf ield、Lehrer等从兔肺泡巨卩蜜细胞中分离出另一种抗菌肽一defenSinS(防御素)。此后，在哺乳动物猪的小肠(1989)及无脊椎动物(1997)等生物中相继发现抗菌肽。目前在从细菌到高等动物(比如人)的所有生物中均发现了不同结构不同分子量的天然抗菌肽。
[0004]最初，人们将这类具有抗菌活性的多肽统称为“antibacterial peptides”，即“抗菌肽”，本意为抗细菌多肽。随后人们发现这类多肽具有抗细菌、病毒、真菌等几乎所有种类微生物的作用，便称之为“antimicrobial peptides”。随着研究工作的深入，发现这类多肽还具有抗寄生虫、杀伤肿瘤细胞等功能，又将其称为“peptide antib1tics” 一“多肽抗生素”。但“抗菌肽”一词已在国内被广泛采用，并且习惯上不包括那些在代谢过程中通过酶促反应合成的多肽性质抗生素，如杆菌肽、多粘菌素E、短杆菌肽S等，而特指由基因编码在核糖体上合成的具有生物活性的多肽，故仍沿用。
[0005]抗菌肽系阳离子多肽(cat1nic peptides)，其本身具有以下二个特点:①抗菌肽分子表面带净正电荷，抗菌肽一级结构中有精氨酸和赖氨酸残基并且最多只有一个带负电荷的氨基酸残基；②抗菌肽系两亲分子(具有疏水性和亲水性)。抗菌肽在多肽链长度、氨基酸构成及二级结构等方面差异极大。抗菌肽长度约11?50个氨基酸残基；分子量2000?8000Dal ;由十余种氨基酸组成；PI较高；对热稳定，100°C持续30min仍保持杀菌活性；对蛋白酶及酸性环境具有较强的耐受性。二级结构为α螺旋、β折叠等多种结构。
[0006]抗菌肽的应用受制于其来源较少而显得困难。天然抗菌肽的纯化费用高、产量少，而且除少数天然抗菌肽如nisin外，多数抗菌活性低于合成的新型抗菌肽。因此，开发新的生产方法对抗菌肽的应用非常重要。
[0007]目前有两种方法被认为有应用前景:多肽自动液相化学合成法(solut1n-phasechemistry synthesis method，与传统的固相合成法不同)和基因工程法(recombinantsynthesis)，其中采用基因工程法在大肠杆菌中表达抗菌肽融合蛋白，抗菌肽的回收率达总蛋白的2%。此外，抗菌肽在酵母中分泌表达量也较高，且后处理简单。
[0008]化学合成法:为了研究抗菌肽的作用机制及临床应用，许多天然抗菌肽及其类似物已通过化学合成的方法得到。其中研究最多的是具有双亲α螺旋结构的带正电荷的多肽。通过改变或增删某些位置的氨基酸，杂合两种抗菌肽等方法，可以研究多肽结构与功能的关系，寻找具有更高抗菌活性或更广抗菌谱的多肽抗生素。例如，由cecropin和melititn的前13个氨基酸组成的杂合肽具有很强的抗菌活性而无溶血活性。化学合成法可以方便地在合成过程中改变多肽的一级结构，加入特殊氨基酸，对多肽末端进行修饰，但成本较高仍是限制该方法广泛应用的最大障碍。
[0009]基因工程法:利用基因工程的方法生产抗菌肽是降低成本的一条有效途径。但是抗菌肽对原核细胞的毒性限制了原核表达系统的应用。为了克服抗菌肽对原核表达系统中细菌细胞的毒性，人们采用融合表达或选择对抗菌肽具有抗性的细菌株系进行原核表达。例如，1993年，Piers等将defensin，HNp-1, cecropin/melittin杂合肽基因分别与不同的载体蛋白相融合，并在大肠杆菌中进行表达。对表达产物的产量、细胞定位、蛋白降解情况进行了较为系统的研究。对其中的一些融合蛋白进行化学裂解或酶解后，得到了具有抗菌活性的小肽。Maeno等利用链霉菌表达系统分泌表达了 apidaecin的融合蛋白，裂解后得到了有活性的产物。国内已在酵母中成功表达抗菌肽AD，并得到活性较高的重组多肽。
[0010]过去的50余年是“抗生素时代”，天然的、合成和半合成的抗生素成功治愈了许多威胁人类生命的感染性疾病。但致病菌对常规抗生素的抗药性日益严重。寻找新型抗生素是解决抗药性的一条有效途径。抗菌肽因抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，被认为有广阔应用前景。
[0011]目前，已有多种多肽抗生素进入临床试验阶段。给药途径包括局部、口服和全身用药(静脉给药)，治疗范围包括局部和全身的细菌和真菌感染。由于抗菌肽的产生是感染局部最重要的防御反应，因此很自然第一个进入临床试验的项目便是用于局部感染。这种给药方法安全有效，因为一些毒性更强的多肽和脂多肽，如短杆菌肽S，多粘菌素B已被用于制造皮肤软膏。此外，有学者将抗菌肽作为探针用于诊断细菌性及真菌性疾病，为避免常规肿瘤化疗对正常细胞的非特异性毒性，利用抗菌肽对肿瘤细胞的靶向特异性，将抗菌肽作为载体进行选择性化疗(peptide-mediated selective chemotherapy)。
[0012]抗菌肽的活性检测目前仍采用Hultmark建立的琼脂扩散法，这种方法最经典、应用最广、引用最多。由于抗菌肽种类多，分子量低，制备提纯流程复杂且费用高、提取量少，因此目前尚无诸如应用单克隆抗体的免疫学方法或其它快速简便检测抗菌肽活性方法的报道。
[0013]蛋白质及多肽的分离纯化的方法很多，如盐析法、透析法、超滤法、离心法、层析法(凝胶过滤法、高效液相色谱法等)、电泳法、等电点沉淀和PH值调节法等，以及多种分离纯化方法的联合应用。对于不同的目标产物，根据蛋白质分子大小及溶解度不同可采取多种分离纯化方法。通常，盐析、离心、沉淀、萃取技术只能获得粗品，而凝胶层析技术，可获得纯度较高的生物产品。蛋白质分离纯化的方法虽然很多，但尚无一种简便、高效、适应范围广的方法能够将蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但根据目标产物的理化和生物特性，选择合适的分离纯化工艺路线，可以获得符合要求的目标产物得率和纯度。
[0014]根据目前的文献检索，抗菌肽的分离纯化多采用层析法。如采用离子交换从牛血液及黄鳝中分离纯化抗菌肽，利用高效液相色谱法对免疫小皱蝽产生的抗菌肽进行了分离纯化，并获得了抗菌肽的纯品。但这种方法流程复杂、费用高、费时长并且提取量少。
【发明内容】
[0015]为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供抗菌肽的分级二次超滤纯化方法，该方法快速、简便、低成本，且纯化效果好。
[0016]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0017]抗菌肽的分级二次超滤纯化方法，包括以下步骤:
[0018]⑴预处理
[0019]不同来源抗菌肽的预处理方法不相同。目的是收集含抗菌肽的液体然后采用分级二次超滤纯化。预处理的步骤一般包括:诱导抗菌肽的产生、收