光滑爪蟾皮肤抗菌肽及其制备方法与用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物化学的技术领域，具体说是一种光滑爪蟾皮肤抗菌肽及其制备方 法与用途。
【背景技术】
[0002] 抗菌肽（Antibacterialpeptide)，又称为抗微生物肽，是免疫系统释放的具有抗 微生物活性的物质，作为先天性免疫成分的一部分广泛存在于自然界的生物体内。抗菌肽 是一种小分子的多肽类物质，具有广泛的生物学活性，表现在其具有杀菌、消炎、抗病毒、抑 制肿瘤等作用，是生物非特异性防御系统的重要组成部分。抗菌肽具有广谱的抗菌活性，可 与革兰阴性菌外膜的脂多糖以及革兰阳性菌表面的肽聚糖结合，从而破坏胞膜而形成穿膜 通道，细胞内容物泄露或因离子流出后高渗破裂而死亡，不易产生耐药性。因此，抗菌肽作 为一种具有高效生物活性且不易产生耐药性的小分子肽，具有极广泛的应用价值。
[0003] 两栖动物的皮肤裸露直接与生活环境相接触，没有鳞片、甲壳以及毛发的保护，但 在两栖动物皮肤的表面，经常会有黏液性的物质覆盖在表面形成了保护屏障。此屏障中含 有大量的结构比较复杂的大分子物质以及功能多样的抗菌活性物质，抗菌肽作为其中的成 分，发挥重要的作用。
[0004] 抗菌肽作为抑菌药物的研究已经广泛深入，其中，小分子抗菌肽的研究成果尤为 显著，小分子抗菌肽不但具有高效的抑菌活性，还由于其分子结构简单而具备合成成本低， 不存在免疫反应等优点。在公开号为103641901A的中国专利中，公开了一种序列为GLPLLI SWIKRKRQQAGPGSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM的抗菌肽。在公开号为102140130A的中国专利中， 公开了一种序列为KCRRRKVHGPMIRIRKK的抗菌肽。上述两种抗菌肽由于其序列较长，存在 二级结构从而导致其合成难度、成本较高。在公开号为103524602A的中国专利中，公开了 一种序列为RRRffffC的6肽抗菌肽，不过该发明中仅阐明了其病毒活性，没有明确其抗肿瘤 等其他功效，并且该专利没有研究该抗菌肽的溶血活性，大大限制了其应用。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种光滑爪蟾皮肤抗菌肽及其制备方法与用途。
[0006] 本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是： 本发明的光滑爪蟾皮肤抗菌肽，是包括4分子天冬氨酸和1分子谷氨酸的序列为Asp-Glu-Asp-Asp-Asp即DEDDD的 5 肽。
[0007] 本发明还可以采用以下技术措施： 本发明的光滑爪蟾皮肤抗菌肽是由4分子天冬氨酸以及1分子谷氨酸组成的序列为Asp-Glu-Asp-Asp-Asp即DEDDD的 5 肽，其分子量为 607. 7Da。
[0008] 本发明的光滑爪蟾皮肤抗菌肽的制备方法，包括以下步骤： A、 提取光滑爪蟾皮肤分泌物； B、 制备型高效液相色谱分离纯化； C、 制备液相分离峰的活性检测； D、 分析型高效液相色谱分离纯化； E、 分析液相分离峰的活性检测及质谱鉴定。
[0009] 所述的步骤A中光滑爪蟾皮肤分泌物由物理刺激光滑爪蟾皮肤后得到。
[0010] 所述的物理刺激为恒压电刺激，电压为15-20V。
[0011] 本发明的光滑爪蟾皮肤抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。
[0012] 本发明的光滑爪蟾皮肤抗菌肽在制备由细菌引起的抗菌药物中的应用。
[0013] 本发明的光滑爪蟾皮肤抗菌肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0014] 本发明的光滑爪蟾皮肤抗菌肽在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
[0015] 本发明具有的优点和积极效果是： 本发明采用物理方法对皮肤进行刺激，极大程度地保护了抗菌肽的结构完整性以及生 物学活性；其次，本发明公开的抗菌肽为小分子多肽，有利于皮肤吸收，还大大降低了其化 学合成的难度及成本，增强了其应用的可能性。最后，本发明公开的抗菌肽具有显著的抑菌 活性，较低的溶血活性以及良好的抗乳腺癌细胞活性，并且没有毒副作用，也不易产生耐药 性，从而大大增强了应用范围。综合以上优势，本发明提供的抗菌肽可以应用到工业生产 中。
【附图说明】
[0016] 图1是本发明的光滑爪蟾皮肤抗菌肽的色谱图； 图2是本发明的光滑爪蟾皮肤抗菌肽的质谱图； 图3是本发明的光滑爪蟾抗菌肽的固相合成色谱图； 图4是本发明的光滑爪蟾抗菌肽的固相合成质谱图； 图5是不同浓度本发明的光滑爪蟾抗菌肽的溶血率； 图6是不同浓度本发明的光滑爪蟾抗菌肽对乳腺癌细胞MCF-7的抑制率。
【具体实施方式】
[0017] 本发明的光滑爪蟾皮肤抗菌肽是由4分子天冬氨酸以及1分子谷氨酸组成的序列 为Asp-Glu-Asp-Asp-Asp即DEDDD的 5 肽，其分子量为 607. 7Da，命名为XLAsp-Pl。
[0018] 1、本发明的光滑爪蟾皮肤抗菌肽采用以下方法制备： I. 1光滑爪蟾皮肤分泌物的获取 取100只光滑爪蟾，用蒸馏水将其皮肤表面清洗干净，去除杂质。利用15V的直流电， 间断性的刺激皮肤表面，诱导皮肤分泌。10min左右可见皮肤分泌出较多无色透明物质，同 时夹杂着白色黏液状物质。使用电压15-20V之间的直流电都可以收到上述分泌效果，用超 纯水收集分泌物，12000rpm离心15min，去除沉淀取上清。上清经0. 45ym滤膜过滤后，用 10KDa的超滤管12000rpm离心20min，以去除大分子蛋白。用金黄色葡萄球菌S.aureus ATCC29213检测粗提物的抗菌活性，利用冻干机对粗提物进行浓缩，后在-40 °C保存。
[0019] 1. 2制备型高效液相色谱分离纯化 将半制备型C18柱同仪器相连接，并且将流动相A(上样缓冲液，水+0. 05%TFA)，B(洗 脱缓冲液，乙腈+0.05%TFA)同仪器的栗相通。调试仪器，并用A液平衡系统，直至吸收值 达到平衡。然后设置自动上样2mL/次，自动收集程序2min/管，流速为2mL/min。并且 根据预实验的结果，设置洗脱程序，如下面表1所示。多次上样，将相同时间的组分合并，而 后进行浓缩。
1. 3制备液相分离峰的活性检测 以金黄色葡萄球菌S.aureusATCC29213作为活性检测使用菌种，利用药敏片法体外检 测分离峰的活性。将菌液稀释到〇. 5麦氏浊度后取IOOML涂到直径为90mm的细菌培养板 上，待即将风干时，把各个分离峰制作的药敏片贴附在琼脂表面，37 °C温箱培养过夜，根据 抑菌圈的有无和大小判定分离峰的活性有无和强弱，具有活性的分离峰作进一步分离。 [0021] 1. 4分析型高效液相色谱分离纯化 为了确定每个活性峰中的活性物质，得到纯度更高的样品从而便于测序实验的进行， 我们利用分析型高效液相色谱（AnalyticalHighPerformanceLiquidChromatography， AnalyticalHPLC)仪对活性峰作进一步的分离。首先将分析型C18柱同仪器相连接，并且 将流动相A(上样缓冲液，水+0. 05%TFA)，B(洗脱缓冲液，乙腈+0. 05%TFA)同仪器的栗对 应相通。调试仪器，A栗和B栗分别purge，并用A液平衡系统，直至吸收值达到平衡。设置 流速为lmL/min，手动上样IOOuL/次，根据吸收峰手动收集。多次上样，合并相同峰并进行 浓缩。洗脱程序设置如表2所示，不同样品根据第一次洗脱效果改动洗脱程序。
1. 5分析液相分离峰的活性检测及质谱鉴定 活性检测的方法同1. 3。利用MALDI-T0F/T0F质谱仪对具有抑菌活性的分离峰进行 鉴定，包括分子量以及纯度。首先将IyL的分离样品和肽标准分别点于抛光靶上，风干 后，再加IuL饱和a-CCA基质（溶剂：0. 1%三氟乙酸+ 50%乙腈）于样品表面，自然干燥。 MALDL-T0F/T0F采用的是正离子和自动获取模式采集数据。先通过利用肽标准品进行校正， 并设定的质量扫描范围为0-4KDa，从而获得样品一级质谱图。通过分析质谱，获得纯度较 高的(达到95%)的组分可进行氨基酸序列的测定。最终分离到符合要求的为第4-9号峰的 抗菌肽，其色谱及质谱图见图1、图2所示。
[0023] 2、光滑爪蟾皮肤抗菌肽氨基酸序列的测定 通过分离纯化及质谱鉴定，对达到测序要求的抗菌肽进行氨基酸测序。ABI491型氨 基酸序列分析仪的原理是Edman降解法：首先是异硫氰酸苯脂同多肽N-端残基进行偶联反 应，形成了苯氨基硫甲酰肽（PTC-肽）;然后PTC-肽经过环化裂解反应后形成噻唑呤酮苯氨 氨基酸（ATZ-AA);最后再经过转化反应，ATZ-AA转化为苯异硫脲氨基酸（PTH-AA)。通过微 梯度运送系统(毛细管HPLC)与标准的PTH-AA的保留时间进对比，利用数据分析软件得到 抗菌肽的氨基酸序列。
[0024] 3、光滑爪蟾皮肤抗菌肽序列的生物信息学分析 通过生物信息学数据库NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)以及Antimicrobial PeptideDatabase(APD， http://aps.unmc.edu/AP/main.html)两大数据库进行搜索比 较，确定所得到的光滑爪蟾皮肤抗菌肽序列与已知任何序列均不相同，因此可判