人肠道病毒的广谱亲和表位多肽、抗体及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫生物学领域，涉及分离的表位多肽（例如人肠道病毒的广谱亲和 表位多肽）、针对该表位多肽的抗体及它们的用途。
【背景技术】
[0002] 人肠道病毒（HumanEnteroviruses，以下简称为HEV)属于小核糖核酸病毒目 (Picornavirales)，小RNA病毒科（Picornaviridae)，肠道病毒属（Enterovirus)。HEV的 基因组结构为单股正链RNA。HEV可分为4组：（1)脊髓灰质炎病毒（Polioviruses，以下简 称为PV);⑵柯萨奇病毒A组（CoxsackievirusgroupA，以下简称为CVA) ; (3)柯萨奇病 毒13组（CoxsackievirusgroupB，以下简称为CVB) ; (4)埃可病毒（Echoviruses，以下简 称为Echo)。此外，HEV还可以根据基因型进行分类，可分为HEV-A、HEV-B、HEV-C及HEV-D 四组（Nasri等人，2007.ExpertRevMolDiagn. 7:419-34)。
[0003] 迄今为止，HEV中危害最大的是PV，该病毒通常经口鼻传播，并感染脊髓神经的 灰白质，数日内可导致手脚麻痹，以致残废，严重者可致死亡。其次是人肠道病毒71型 (Enterovirus71，以下简称为EV71)，该病毒的传播途径与PV相似，通常引起手足口病 (Handfootandmouthdisease，以下简称为HFMD)和疱疼性咽峡炎（herpangina)，还可 导致无菌性脑膜炎（asepticmeningitis)、脑干脑炎（brainstemencephalitis)、肺水 肿（pulmonaryedema)、肺出血（pulmonaryhemorrhage)等多种神经系统疾病（Lee等人， 2009.PediatrInfectDisJ. 28:904-910)。除了上述2种危害性较大的肠道病毒外，其它 的多种肠道病毒（包括CVA、CVB及Echo)也可导致HFMD，或引起胰腺、心脏及肺部相关疾 病的发生（Tseng等人，2007.JMedVirol. 12: 1850-60)。
[0004]HEV的病毒颗粒近似于球形，为正二十面体结构，无包膜和突起。HEV由外部的衣 壳和核心的RNA构成。衣壳由结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4构成，VP1-VP3位于衣壳外 部，VP4则位于内侧与RNA核心相连。HEV的基因组从5'端至3'端依次为：5'端非编码区 (5' -UTR)、Pl编码区、P2编码区、P3编码区及3'端非编码区（3' -UTR);其中，P1-P3编码 区编码1A(VP4蛋白）、1B(VP2蛋白）、1C(VP3蛋白）、1D(VP1蛋白）、2A(特异性蛋白酶）、 2B(膜锚定蛋白）、2C(多功能蛋白）、3A(膜锚定蛋白）、3B(VPg，5'末端结合蛋白）、3C(特 异性蛋白酶）、3D(RNA多聚酶组分）、3'末端非编码区以及多聚腺苷酸尾（Oberste等人， 2004.JGenVirol. 85:1597;Norder等人，2011.AntiviralRes. 89:204-218) 〇
[0005] 近年来，HEV不断导致包括HFMD等在内的疾病爆发。开发针对HEV的检测方法以 及有效的预防和治疗性药物（例如抗体、疫苗等）具有重大意义。
【发明内容】
[0006] 本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，鉴定了人肠道病毒中的关键表位多肽 (例如氨基酸序列为SEQIDNO: 1的表位多肽）。进一步，本发明人制备了所述表位多肽 并将其用于免疫小鼠，或者利用重组表达或表面展示技术将所述表位多肽与其它载体或蛋 白进行偶联或融合表达并将所获得的产物用于免疫小鼠，获得了针对所述表位多肽的抗血 清。进一步，本发明人利用免疫荧光检测方法或酶联免疫检测方法，检测了针对所述表位多 肽的抗血清与不同基因型或血清型的人肠道病毒的反应能力。结果显示，针对本发明的表 位多肽（例如氨基酸序列为SEQIDNO: 1的表位多肽）的抗血清对不同基因型或血清型的 人肠道病毒均有良好的反应活性。进一步，本发明人进行了单克隆抗体的制备，鉴定获得了 1株杂交瘤细胞株，其能够产生与本发明的表位多肽（例如氨基酸序列为SEQIDNO: 1的 表位多肽）具有特异性反应的单克隆抗体。进一步，本发明人利用免疫荧光检测方法或 酶联免疫检测方法，检测了上述单克隆抗体与不同基因型或血清型的人肠道病毒的反应能 力。结果显示，本发明的单克隆抗体对所用的不同基因型或血清型的人肠道病毒均有良好 的反应活性。这些结果表明，发明人所鉴定的表位（例如氨基酸序列为SEQIDNO: 1的表 位）是人肠道病毒中的关键的保守性表位，其能够被用于制备人肠道病毒广谱亲和抗体、 治疗药物或疫苗，并且能够被用于制备人肠道病毒通用检测方法或试剂盒。因此，本申请提 供了下述发明。
[0007] 1、分离的表位多肽
[0008] 本发明的一个方面涉及分离的表位多肽，特别是广谱亲和表位多肽，尤其是人肠 道病毒的广谱亲和表位多肽。
[0009] 特别地，本发明涉及一种分离的表位多肽或其变体，其中，所述表位多肽由肠 道病毒非结构蛋白2C的连续氨基酸片段组成，并且包含肠道病毒非结构蛋白2C的aa 155-170(相应于由肠道病毒基因组翻译的氨基酸序列的aa1266-1281)，并且，所述连续 氨基酸片段的长度为16-30个氨基酸，例如16-25个、16-20个氨基酸；所述变体与所述表 位多肽的区别在于个或几个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个）氨基酸取代、缺失或 添加，并且保留所述表位多肽的活性（例如，诱导广谱亲和抗体产生的能力）。
[0010] 在某些实施方案中，所述肠道病毒非结构蛋白2C的氨基酸序列如SEQIDNO: 10 所示。在某些实施方案中，所述肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170如SEQIDNO:1和 22-85任一项所示。在某些实施方案中，所述肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170如SEQ IDNO:1 所示。
[0011] 在某些实施方案中，所述表位多肽或其变体包含选自下列的氨基酸序列，或由选 自下列的氨基酸序列组成：
[0012] a)如SEQIDNO:1和22-85任一项所示的氨基酸序列；
[0013]b)与SEQIDNO:1和22-85任一项所示的氨基酸序列具有至少45%的序列同一 性，例如至少50 %，至少55 %，至少60 %，至少65 %，至少70 %，至少75 %，至少80 %，至少 85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%序列同一性的氨基 酸序列；和
[0014]c)相对于SEQIDNO:1和22-85任一项所示的氨基酸序列包含一个或几个（例 如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个）氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列。
[0015] 在某些实施方案中，所述氨基酸取代或缺失发生在一个或多个选自下列的位置 处：相应于SEQIDN0:1所示氨基酸序列的第2、3、5、6、8、9和/或12位氨基酸残基的位 置处（即，相应于肠道病毒非结构蛋白2C的第156、157、159、160、162、163和/或166位氨 基酸残基的位置处，或相应于由肠道病毒基因组翻译的氨基酸序列的第1267、1268、1270、 1271、1273、1274和/或1277位氨基酸残基的位置处）。
[0016] 在某些实施方案中，所述表位多肽选自：
[0017] (a)表位多肽，它为肠道病毒非结构蛋白2C的片段（其长度为16-30个氨基酸，例 如16-25个或16-20个氨基酸），并且含有肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170(例如， SEQIDNO:1和22-85任一项所示的氨基酸序列）；
[0018] (b)表位多肽，它是在肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170(例如，SEQIDNO: 1和22-85任一项所示的氨基酸序列）的基础上经一个或者几个（例如1-5个、1-10个或 1-15个）氨基酸的延伸和/或替换而得到的；和
[0019] (c)表位多肽，它的氨基酸序列与肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170(例如， SEQIDNO:1和22-85任一项所示的氨基酸序列）相异在于一个或者几个（例如1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10个）氨基酸的延伸和/或替换。
[0020] 在某些实施方案中，所述表位多肽或其变体具有诱导广谱亲和抗体产生的能力。
[0021] 在某些实施方案中，所述表位多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1和22-85任一项 所示。
[0022] 在某些实施方案中，所述变体与所述表位多肽的区别在于选自下列的位置处的 一个保守性置换：相应于SEQIDN0:1所示氨基酸序列的第2、3、5、6、8、9和/或12位氨基 酸残基的位置处（即，相应于肠道病毒非结构蛋白2C的第156、157、159、160、162、163和/ 或166位氨基酸残基的位置处）。
[0023] 在某些实施方案中，所述分离的表位多肽包含如SEQID NO:I(YSLProroHFDGYKQQ)所示的氨基酸序列或其衍生物或变体，或者由其组成。
[0024] 在某些实施方案中，所述分离的表位多肽包含SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列的 衍生物或变体。在某些实施方案中，所述衍生物或变体与SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列 具有至少45 %的序列同一性，例如至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%， 至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至 少95 %的序列同一性。
[0025] 在某些实施方案中，所述分离的表位多肽包含SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列的 衍生物或变体。在某些实施方案中，所述衍生物或变体为在如SEQIDNO: 1中所示的氨基 酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个（例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个或8 个）氨基酸而衍生的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述分离的表位多肽相对于SEQID N0:1中所示的氨基酸序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸修饰（例如，取代、 缺失或添加等）。可产生所述分离的表位多肽的氨基酸序列衍生物，从而使它们是取代、插 入或缺失衍生物。缺失衍生物缺少天然多肽的一个或多个对于功能（例如，特异性产生抗 体或与抗体结合）不是必需的残基。插入衍生物通常包括，添加在多肽中的非末端位点的 残基。取代衍生物通常涉及在氨基酸序列内的一个或多个位点上包含一种氨基酸与另一种 氨基酸的替换/取代，并且可被设计来调节多肽的一种或多种性质，例如抗蛋白水解切割 的稳定性，而不丧失其它功能或性质。该类型的取代优选是保守的，即，一种氨基酸被具有 相似形状和电荷的氨基酸替代。保守取代在本领域是公知的，包括例如如下变化：丙氨酸至 丝氨酸；精氨酸至赖氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸 至丝氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺 或谷氨酰胺；异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸至精氨酸； 甲硫氨酸至亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸至苏氨酸； 苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸至异亮氨酸 或亮氨酸。
[0026] 在某些实施方案中，氨基酸的取代或缺失可发生在一个或多个选自下列的位置 处：SEQIDNO: 1所示氨基酸序列的第2、3、5、6、8、9和/或12位的氨基酸处（相应于肠道 病毒非结构蛋白2C的第156、157、159、160、162、163和/或166位氨基酸残基的位置处）。
[0027] 所述的多肽或亲和表位多肽可以通过人工化学合成的方式得到，也可以由本领域 技术人员知悉的其它生物化学或者分子生物学的方法得到，例如参考核苷酸序列SEQID NO: 2(TACTCGCTTCCACCAGACCCAGACCATTTTGACGGTTACAAGCAACAG)、SEQID NO: 3(GTCTGGGTCTGGTGGAAGCGAGTACTGTTGCTTGTAACCGTCAAAATG)，通过基因 重组手段克隆到表达载体后转染宿主细胞进行蛋白表达。例如，可以在合适的培养基中，在 允许多肽表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中小规模或大规 模发酵（包括连续、分批、分批加料或固态发酵）来培养细胞。在包含碳和氮源以及无机盐 的合适的培养基中，采用本领域已知的步骤进行培养。合适的培养基可由供应商提供或者 可以参照公开的组成（例如，美国典型培养物保藏中心的目录中所述）来制备。如果多肽 被分泌到培养基中，则可以直接从培养基中回收多肽。如果多肽不分泌，可以从细胞裂解物 中回收。
[0028] 2、多肽偶联物
[0029] 在另一个方面，本发明涉及一种多肽偶联物，其包含本发明的表位多肽或其变体， 和偶联部分。在某些实施方案中，本发明涉及一种表位多肽偶联物，其包含本发明的分离的 表位多肽（例如广谱亲和表位多肽，尤其是人肠道病毒的广谱亲和表位多肽，其衍生物或 变体）和偶联部分。
[0030] 在某些实施方案中，偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光 素、载体蛋白、脂类、和生物素中的一种或多种。
[0031] 在某些实施方案中，所述亲和表位多肽偶联物为融合蛋白或类病毒颗粒。在某些 实施方案中，所述偶联部分为HBcAg蛋白或其片段。在某些实施方案中，所述HBcAg蛋白 的片段为HBcAg蛋白的aa1-149。在某些实施方案中，HBcAg蛋白的氨基酸序列如SEQID NO: 11所示。
[0032] 在某些实施方案中，所述偶联部分通过已知的偶联方法与所述表位多肽连接。在 某些实施方案中，所述偶联方法可以是MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基 苯法及亚胺酸脂法等。
[0033] 在某些实施方案中，所述载体蛋白包括例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲状 腺球蛋白、钥孔血白蛋白及其他Y球蛋白等蛋白类载体。在某些实施方案中，所述偶联部 分可以为重组载体，例如多聚赖氨酸、二软脂酰赖氨酸、三软脂酸-S甘油半胱氨酰_丝氨酰 基丝氨酸、多聚谷氨酸及多聚混合氨基酸等。
[0034] 在某些实施方案中，所述分离的表位多肽与所述偶联部分通过连接子相连。所述 连接子可以为肽或多肽，例如氨基酸序列为SEQIDN0:6中所示的肽或多肽。
[0035] 在一个具体的实施方案中，所述多肽偶联物包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序 列、其变体或衍生物。
[0036] 3、分离的核酸分子
[0037] 在另一个方面，本发明还提供分离的核酸分子。
[0038] 在某些实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的分离的表位多肽（例如广 谱亲和表位多肽，尤其是人肠道病毒的广谱亲和表位多肽）、其衍生物或变体。
[0039] 在一些实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的多肽偶联物，例如融合蛋 白。所述多肽偶联物包含本发明的分离的表位多肽（例如广谱亲和表位多肽，尤其是人肠 道病毒的广谱亲和表位多肽）、其衍生物或变体，和偶联部分。
[0040] 在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含SEQIDNO: 2(TACTCGCTTCCACCA GACCCAGACCATTTTGACGGTTACAAGCAACAG)或SEQIDNO: 3(GTCTGGGTCTGGTGG AAGCGAGTACTGITGCTTGTAACCGTCAAAATG)中所示的核苷酸序列，其衍生物或变体， 或由它们组成。
[0041] 在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含的核苷酸序列编码包含如SEQID NO: 9所示的氨基酸序列的融合蛋白，其衍生物或变体，或由它们组成。
[0042] 在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含的核苷酸序列与SEQIDNO:2或SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列或者编码SEQIDN0:9的核苷酸序列具有至少45%的序列同一 性，例如至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少 85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%的序列同一性。
[0043] 在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含的核苷酸序列为在如SEQIDNO:2 或SEQIDNO:3所示的核苷酸序列或者编码SEQIDN0:9的核苷酸序列中经过取代、缺失 或添加一个或几个核苷酸而衍生的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述分离的核酸分子 相对于SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示的核苷酸序列或者编码SEQIDNO: 9的核苷酸序 列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸修饰（例如，取