一种基于peg修饰的j亚群禽白血病病毒免疫抑制性多肽的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子免疫学和病毒学领域，具体涉及了一种基于PEG修饰的J亚群禽 白血病病毒免疫抑制性多肽。
【背景技术】
[0002] J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒（ALV-J)引起的一种肿瘤性疾病，主要 临床表现为髓细胞性白血病，并以免疫耐受、高死亡率、生长迟缓和多组织器官出现肿瘤等 为主要特征。持久的免疫应答损害导致继发感染和混合感染频发，严重危害着养殖业的健 康发展。对我国近十年来J亚群禽白血病流行状况跟踪调查显示，J亚群禽白血病的早期 感染、多重感染已相当普遍，呈现高感染率、高发病率；混合感染多发/频发；肿瘤谱扩展； 病理变化日益复杂，加之严重的免疫抑制降低了群体疫病的基本抵抗力，不仅造成了疾病 的多样性，增加了继发其它疾病的机率，而且显著降低了疫苗对禽群的免疫保护，致使新城 疫、禽流感等一类传染病频频出现免疫失败，对于禽群的健康养殖危害严重。
[0003] 由于ALV-J病毒囊膜蛋白的超变性及其自身的免疫逃避能力，加之药物、疫苗研 制的周期性，至今尚无有效控制和防治的药物或疫苗用于临床使用。国外是通过净化来控 制本病的发生。由于净化周期长、成本高、加之多元化的养殖模式，目前，净化在我国还未能 有效实施，大型养殖公司采用净化，但内源性病毒的误淘问题严重；不合理、不科学的净化 措施，还会加速病毒的进化和突变，使疾病愈加复杂。中小型养殖公司只能通过临床症状观 察淘汰鸡只。从1999年至2014年以来，国内学者对J亚群禽白血病的研究显示：ALV-J的 感染率从未低于10%，基于临床上对J亚群禽白血病防控的技术需求，研制安全高效的抗J 亚群禽白血病毒药物、疫苗成为有效控制J亚群禽白血病亟待解决的问题。
【发明内容】
[0004] 针对现有存在的上述问题，本发明提供了一种基于PEG修饰的J亚群禽白血病病 毒免疫抑制性多肽，提供了一种基于N-末端a-NH2PEG修饰的免疫抑制性多肽（ISU)及 其制备方法，采用本发明提供的PEG修饰后的ISU肽与现有技术中ISU免疫抑制肽相比能 更为显著地抑制ALV-J复制，为J亚群禽白血病的防治和制备PEG化多肽疫苗提供科学基 础和技术支撑，有效降低养禽业因ALV-J感染造成的经济损失。
[0005] 本发明是基于下述理论基础进行的深入研究获得的：
[0006] 天然多肽参与调控各种生理功能，在临床应用上具有非常重要的开发价值。随着 小分子化学和大分子蛋白药物开发难度的增大，越来越多地人们把注意力投向多肽和蛋白 质类药物。多肽具有选择性强，特异性强，副作用小，在常温下更稳定，技术成熟且成本低等 特点。但相对半衰期短，体内稳定性差，改造修饰或与其他材料组成稳定的复合物来提高其 稳定性是目前多肽药物研发的热点。其中应用最广泛的修饰剂为单甲氧基聚乙二醇（mPEG) 及其衍生物。目前，PEG已应用于多种蛋白药物的修饰，如PEG修饰的门冬酰胺酶、干扰素 a2a和2b等多种蛋白质药物已陆续通过FDA批准应用与临床。PEG修饰化药物有如下优 点：改善药物的动力学性质（半衰期延长，清除率下降，血药峰浓度下降）；血浆药物浓度波 动减小；增强药物在体内的活性；降低药物的毒性及免疫原性；增强药物的理化稳定性并 避免蛋白药物的水解；增加蛋白质药物的可溶性等。
[0007]ALV-J是具有囊膜的反转录病毒，ALV-J前病毒具有典型慢性转化型反转录病毒 完整的基因结构，基因排列顺序为LTR-Leader-gag-pol-env-LTR主要包含gag、pol和env 三个基因。其中，env基因含有表面膜蛋白合成的遗传信息，能够编码病毒囊膜糖基化蛋白， 包括膜表面糖蛋白亚单位gp85和跨膜蛋白亚单位gp37。gp85蛋白是病毒的主要抗原，病 毒中和反应的作用位点，含有病毒-受体决定簇，主要起病毒粘附于易感动物细胞的作用， 同时也能诱导有免疫力的鸡群产生特异性抗体，称为表面膜蛋白（SU);gp37包含，介导病 毒与细胞的融合过程，称为跨膜蛋白（TM)。TM内包括折叠的一段高度保守的免疫抑制序列 (免疫抑制区）ISU，ISU肽称为免疫抑制性多肽，可以在体内、外抑制淋巴细胞的活性，由27 个氨基酸组成：LQNRAAIDFLLLAQGHGCQDVEGMCCF，不同ALV毒株ISU不存在毒株之间的差异， 具有极为显著的临床学意义。（ok)
[0008] 基于上述的PEG修饰技术，以及J亚群禽白血病病毒免疫抑制性多肽ISU的研究， 发明人获得了本发明的具体技术方案：
[0009] 人工合成ISU肽并对其鉴定；检测ISU肽的免疫活性；优化高修饰率的PEG-ISU肽 制备条件；检测PEG-ISU肽的修饰率；确证ISU肽与PEG-ISU肽体外抑制病毒复制效果确定 其有效剂量，更为具体步骤如下：
[0010] 已知禽白血病病毒各亚群代表毒株中TM蛋白内高度保守氨基酸序列： LQNRAAIDFLLLAQGHGCQDVEGMCCF，该氨基酸序列如序列表SEQIDN0:1所示，采用现有技术 人工合成上述序列所示的ISU肽，经高效液相色谱法分析纯化，纯度为97%以上；
[0011] 上述获得的人工合成ISU肽的免疫活性检测：
[0012] 通过无菌研磨SPF鸡的脾脏细胞获取实验所需要的淋巴细胞，分别加入人工合成 的ISU肽、ALV-JNX0101病毒液，同时设空白对照组和鸡IgG作为无关蛋白组，培养12h后 经流式细胞定量检测；结果显示，接种人工合成ISU肽和ALV-JNX0101两个组的⑶4+T淋 巴细胞和⑶S+T淋巴细胞明显少于接种无关蛋白鸡IgG和空白对照组。由此可见，人工合成 ISU肽对淋巴细胞的生长具有良好的抑制作用。由于ALV-JNX0101感染细胞后需要经过对 淋巴细胞进行一系列作用才能产生免疫抑制效果，因此，12h后检测结果显示人工合成ISU 肽直接作用于淋巴细胞的抑制效果比相同条件下ALV-JNX0101产生的抑制效果更明显；
[0013] 对mPEG-ALD修饰ISU肽的制备条件筛选：首先设置mPEG-ALD的初始修饰条件： 蛋白质的反应浓度为I. 6mg/mL，反应物摩尔质量比ISU:PEG= 1:5,NaBH3CN的终浓度Img/ ml，反应体系的pH为5,反应温度为4°C，修饰反应时间为24h，加入过量甘氨酸终止反应。 分别对初始修饰条件中的PH、反应物的摩尔比、反应时间、反应温度进行优化。结果显示，在 50mmol/L磷酸盐缓冲液中，pH= 6. 0、4°C(PEG/protein)摩尔比为 3: 1，反应 24h为PEG-ALD 修饰的最优条件。其具体过程如下：
[0014] 在pH=6的磷酸盐缓冲液中，取适量的ISU肽，使其反应浓度为1.6mg/mL;再 加入一定量NaBH3CN,使其终浓度为lmg/ml;之后按反应物摩尔比ISU:PEG=1:3来称取 mPEG-ALD并加入到上述溶液中，在4°C下充分搅拌混匀24h后加入过量的甘氨酸终止反应 即得PEG修饰后的ISU肽，即目标产物PEG-ISU肽。
[0015]PEG-ISU肽与ISU肽在体外抑制病毒复制检测：对ALV-JNXOlOl病毒进行TCID5q 测定，结果显示其TCID5q= 10 4'5/100yL，说明ALV-JNX0101稀释IO4'5接种100yL可使 50%的细胞感染该病毒。将ISU肽与PEG-ISU肽分别接种在已经接种ALV-J中国野毒株 NX0101的DFl细胞上，以同等条件下只接种同剂量ALV-J中国野毒株NXO101的细胞作为阳 性对照，正常细胞作为阴性对照，提取细胞RNA，荧光定量PCR法进行病毒含量检测。结果 显示，DFl细胞维持培养7天后，ISU组与PEG-ISU组病毒含量均低于仅接种ALV-J组，而 且PEG-ISU组病毒含量低于ISU组，说明经过PEG修饰的ISU具有比单纯的ISU更好的免 疫效果。
[0016] PEG-ISU抑制病毒复制有效剂量的检测：将DFl细胞接种30yLTCIDm = 10 4'5/100yL的ALV-J中国野毒株NX0101，12h后接种2倍比稀释的PEG-ISU，以同等条件 下只接种同等剂量ALV-J中国野毒株NX0101的细胞作为阳性对照，正常细胞作为阴性对 照，培养2天后，提取细胞RNA，荧光定量PCR法检测病毒含量。结果显示，接种2倍比稀释 PEG-ISU的4个组中，病毒含量均明显低于仅接ALV-J的阳性对照组。与正常组检测结果 对比，发现 30yLI. 6mg/mL的PEG-ISU肽可以完全抑制 30yLTCID5q = 10 4'5/100yLALV-J 复制，并且在一定范围内随着多抗接种量的减少病毒含量增多。由此可见，PEG-ISU肽能明 显地抑制ALV-J复制，且PEG-ISU肽的最适浓度为I. 6mg/mL。
[0017] 综上所述，与现有技术相比，本发明提供了提供了mPEG-ALD修饰ISU肽的具体制 备条件和制病毒复制的有效剂量，进而提供了一种可有效控制J亚群禽白血病病毒感染的 方法，解决了养禽业J亚群禽白血病病毒感染有效控制的难题，与传统方法相比较，能大幅 度的降低J亚群禽白血病造成的直接和间接经济损失，开创了禽肿瘤性病毒防治研究的新 思路。
【附图说明】
[0018] 图1为人工合成的ISU肽HPLC纯化图；
[0019] 图2为人工合成的ISU肽的MS鉴定图；
[0020] 图3为人工合成的ISU肽I体外免疫活性流式细胞定量检测结果示意图；
[0021] 图4和图5为图3的柱状示意图；
[0022] 图6-10为mPEG-ALD修饰ISU肽的制备条件筛选过程参考图；
[0023] 图11为PEG单修饰率检测结果示意图；
[0024] 图12为RNA电泳及荧光定量PCR结果结果示意图。
【具体实施方式】
[0025] 本实施例中除特殊说明外，其他均采用现有技术完成。
[0026] 实施例1人工合成ISU肽并对其鉴定
[0027] 根据已知禽白血病病毒各亚群代表毒株中TM蛋白内高度保守氨基酸序列： LQNRAAIDFLLLAQGHGCQDVEGMCCF，该氨基酸序列如序列表SEQIDN0:1所示，采用现有技术 人工合成上述序列所示的ISU肽。经高效液相色谱法分析纯化（如图1所示）和MS鉴定 (如图2所示），鉴定其纯度为97 %以上。
[0028] 实施例2ISU肽的免疫活性检测
[0029] 通过无菌研磨SPF鸡的脾脏细胞获取实验所需要的淋巴细胞，为ISU免疫活性实 验提供所必需的实验细胞。将来源于脾脏的淋巴细胞培养于12孔细胞培养板，经过细胞计 数调整细胞密度为I.OXIO6/孔，分成4个组别，组别1加入ISU肽浓度为每孔20yg/ml， 组别2加入30yIALV-JNX0101病毒液，组别3加入鸡IgG作为无关蛋白对照，浓度为每孔 20yg/ml，组别4以正常生长的淋巴细胞作为空白对照，然后相同条件下，每组别做3个平 行对照，在37°C的5%CO2培养箱内培养12h后进行流式细胞定量检测。
[0030] 流式细胞术的检测方法
[0031] 收集脾细胞，分别加入2%?8〇8 131^€61'溶液11111，吹勾，4°〇 2000印1]1离心5111；[11，然 后倒掉上清液。加入2%FacsBuffer溶液200yL，吹勾。每管取出IOyL加入三管，作为 阴性对照组、⑶4+抗体单染组和⑶8 +抗体单染组，然后4°C2000rpm离心5min，然后倒掉上 清液，加入适量的⑶4+抗体和⑶8 +抗体混合液，⑶4 +抗体单染组和⑶8 +抗体单染组分别只 加入适量的⑶4+抗体液和⑶8 +抗体液，然后分别吹匀，4°