邻苯二甲酸二乙酯人工免疫原及其制备和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种邻苯二甲酸二乙酯人工免疫原DEP-BSA及其制备和用途，具体涉 及的是一种用于新兴持久性有机污染物一一邻苯二甲酸二乙酯免疫检测的邻苯二甲酸二 乙酯人工免疫原DEP-BSA及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 邻苯二甲酸酯类塑化剂（缩写为PAEs)，又称酞酸酯类，是一类由邻苯二甲酸与含 有4-15个碳的醇发生费歇尔（Fischer)酯化反应所形成的酯的重要衍生物的统称。这类物 质有特殊性气味，毒性较大，一般情况下状态为粘稠液体；液态条件下温度范围宽，流动性 大，挥发性低，不溶于水，易溶于大多数有机溶剂。这类物质用途广泛，它不仅可作为食品包 装材料、玩具、农药载体、驱虫剂、润滑剂、乙烯地板和壁纸、去泡剂、清洁剂、医用材料（如 人工心脏瓣膜等人工器官、血袋、注射器和胶管）和个人护理用品（主要有化妆品、香味品、 指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液）等近千种产品的生产原材料，还常作为塑料增塑剂被 用于改造塑料制品性能。
[0003] 其中，邻苯二甲酸二乙酯（英文名称：Diethylphthalate，简称DEP)，又名酞酸二 乙酯，CAS号为84-66-2,分子式为C12H14O4，分子量为222. 24,无色至微黄色澄清油状液体， 极易溶解于乙醇，几乎不溶于水；遇明火、高热可燃烧，具有刺激性。该物质低毒，对皮肤、 眼睛、上呼吸道有刺激作用；经皮肤吸收或摄入后可引起头痛、头晕和呕吐；具潜在的光毒 性、轻度致敏；对女性子宫有影响，可能导致胎儿畸形或死亡 ]。由于它能与大多数树脂的相 容性比较好，因此，它主要作为树脂的增塑剂而广泛应用；此外，还可作为润滑剂、起泡剂、 香水及药用包衣材料的辅料。近些年来，有研究学者发现该物质在食品（如：酒、饮料等） 中的含量过高从而危及食品安全，因此便备受人们关注。
[0004]目前，关于邻苯二甲酸二乙酯的研究主要集中在水体、沉积物、大气等环境领域和 生物体的毒性方面，但样品的检测方法方面研究较少。目前对邻苯二甲酸二乙酯的检测手 段主要为气相色谱和高效液相色谱等仪器检测方法，这些方法虽然准确可靠，但对样品的 预处理方法和操作人员的专业性有很高的要求。正因为这些方法的处理复杂、耗时、仪器价 格昂贵而不适合推广使用，也不利于在环境污染事故现场快速检测。为克服这些缺点，寻求 一种快速、简便、灵敏且经济实用的分析方法就成为环境监测领域的主要研究方向。
[0005] 20世纪60年代发展起来的免疫分析（Immunoassay,IA)是基于抗原和抗体的特 异性、可逆性结合反应的分析技术。免疫分析具有常规理化分析技术无可比拟的选择性和 高灵敏性，非常适合复杂介质中痕量组分的分析。因此免疫分析具有的特异性强、灵敏度 高、方法快捷简单、分析通量大、检测成本低等优点，使得该类方法可以满足简单、快速、灵 敏地检测持久性有机污染物的要求。1971年Engvail,VanWeerman等报道了检测体液中 微量物质的固相免疫分析技术，即酶联免疫吸附分析法（enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)。目前，ELISA方法已经成为免疫分析方法中重要的组成部分。ELISA方法是 将抗原-抗体之间的免疫反应与酶的高效催化特性有机结合而发展起来的一种免疫分析 方法。其中，以亲和素-生物素信号放大系统为基础的亲和素-生物素化酶联免疫吸附分 析法，以生物素标记抗体（抗原），并以酶标亲和素代替ELISA方法中酶标抗体。亲和素是 卵白蛋白中的一种碱性糖蛋白，分子量约为68kDa。一个亲和素分子由4个亚单位组成，每 个亚单位都可以与一个生物素分子（分子量为244)特异性结合。生物素与亲和素结合特 异性强，其亲和力比抗原抗体反应大得多，亲和常数高达1015M1。由于一个亲和素能与4个 生物素分子结合，因此在检测中可提高被固相结合酶的数量，进而提高检测方法的灵敏度。
[0006] 现有技术中，一篇名为"环境激素邻苯二甲酸二甲酯（二乙酯）的荧光免疫分析新 方法研究"的硕士论文中公开了一种邻苯二甲酸二乙酯的荧光免疫分析方法，但该方法中 免疫原制备方法粗糙，不易重复出来。
[0007]目前尚没有亲和素-生物素化酶联免疫吸附分析法检测邻苯二甲酸二乙酯的相 关报道。而制备合格的DEP人工免疫原是生物免疫得到高特异性抗DEP抗体的前提，更是 建立DEP免疫检测分析方法的关键，这将具有重要的应用价值和理论研究意义。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种步骤简单，速度快，产率高的邻 苯二甲酸二乙酯人工免疫原（DEP-BSA)制备方法，为免疫得到特异性抗体和利用人工抗 原、抗体建立免疫检测方法奠定基础。
[0009] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0010] 本发明提供了一种邻苯二甲酸二乙酯的人工免疫原DEP-BSA，其特征在于，结构式 如式⑴所示：
[0012] 本发明还提供了一种邻苯二甲酸二乙酯的人工免疫原DEP-BSA的制备方法，所述 方法包括以下步骤：
[0013] 采用重氮化法将DEP半抗原与蛋白质分子BSA偶联制备人工免疫原DEP-BSA。
[0014] 优选地，所述DEP半抗原的制备方法包括如下步骤：
与乙醇发生酯化反应，生成4-硝基邻苯二甲酸二乙酯；
[0016] A2、在非质子性有机溶剂存在的条件下，所述4-硝基邻苯二甲酸二乙酯和锌粉、 强酸b发生还原反应，生成邻苯二甲酸二乙酯半抗原，S卩DEP半抗原。
[0017]DEP半抗原化学名称为4-氨基邻苯二甲酸二乙酯，分子式为C12H15NO4，分子量： 237. 25。
[0018] 优选地，所述步骤Al中，4-硝基邻苯二甲酸、乙醇、强酸性介质a的摩尔比为 1: (5~7) : (0. 6~0. 8)，反应液a的温度为86~90°C，酯化反应时间为8~10小时；所 述步骤A2中，4-硝基邻苯二甲酸二乙酯、非质子性有机溶剂a、强酸b和锌粉的摩尔比为 1: (550~580) : (20~22) : (18~20)，反应液b的温度为25~35°C，还原反应时间为10~ 12小时；所述强酸性介质a和强酸b独立地选自浓盐酸、浓硫酸或浓硝酸中的一种，所述非 质子性有机溶剂选自苯或甲苯。
[0019] 理想状态下，4-硝基邻苯二甲酸、乙醇的摩尔比是1:2,但为了反应顺利进行，一 般乙醇的用量是4-硝基邻苯二甲酸的摩尔量的5倍以上，但不能超过4-硝基邻苯二甲酸 的摩尔量的7倍；此外，强酸作为酯化反应的催化剂，所用量一般是原料4-硝基邻苯二甲酸 摩尔量的0. 6倍以上，但不超过原料4-硝基邻苯二甲酸摩尔量的0. 7倍；乙醇在86°C处于 沸腾状态，那么90°C更处于沸腾状态，反应向右进行。此外，理想状态下4-硝基邻苯二甲酸 二乙酯、强酸和纯锌粉的摩尔比是1:10:10,但为了反应顺利向右进行，一般纯锌粉的用量 是原料4-硝基邻苯二甲酸二乙酯摩尔量的18倍以上，但不能超过原料4-硝基邻苯二甲酸 二乙酯、摩尔量的20倍；此外，强酸作为还原反应的强氧化剂，所用量一般是原料纯锌粉摩 尔数的1倍以上，但不超过原料纯锌粉摩尔数的I. 1倍，而非质子性有机溶剂苯的摩尔数需 要是强氧化剂摩尔数的25倍以上，但不超过强氧化剂摩尔数的28倍。
[0020] 优选地，所述步骤Al还包括酯化反应完全后，蒸馏除去未反应的乙醇和生成的 水，再趁热将液体倒入冰水中，析出的油状粗品用10%Na2OV^液洗涤至水层呈无色，干燥 DEP半抗原中间体的步骤。
[0021] 优选地，所述步骤A2还包括还原反应完全后，用冰水和强碱溶液以终止反应，萃 取反应液，分离，除杂质，干燥，重结晶，层析柱分离纯化DEP半抗原的步骤。
[0022] 优选地，所述强碱选自氢氧化钠或氢氧化钾。
[0023] 优选地，所述锌粉为纯锌粉，即化学级别分析纯，国药试剂公司生产。
[0024] 优选地，所述采用重氮化法将DEP半抗原与蛋白质分子BSA偶联制备人工免疫原 DEP-BSA具体包括以下步骤：
[0025]B、将DEP半抗原溶于强酸c中，形成DEP半抗原溶液；向DEP半抗原溶液中加入亚 硝酸钠溶液，反应，生成重氮盐溶液；
[0026] C、将牛血清蛋白BSA溶于硼酸钠缓冲液中，形成牛血清蛋白溶液；
[0027]D、向所述重氮盐溶液中加入牛血清蛋白溶液形成反应液，搅拌反应。
[0028] 本发明采用重氮化法合成邻苯二甲酸二乙酯人工免疫原，其反应方程式如下：
[0029]
[0030] 上述反应方程式中，中间产物重氮盐与牛血清蛋白BSA结合，偶联脱水，生成了
[0031] 优选地，步骤B中，所述DEP半抗原、强酸c、亚硝酸钠、牛血清蛋白BSA的摩尔比为 1:3~4:8~10:0. 001~0. 01 ;所述强酸c为浓盐酸、浓硫酸或浓硝酸中的一种。
[0032] 优选地，步骤B的反应过程还包括用pH试纸控制反应酸度为2. 0-3. 0,反应结束后 加尿素去除未反应的亚硝酸钠；所述DEP半抗原与尿素的摩尔比为I:300~320。
[0033] 优选地，步骤D中，所述搅拌时间为2~4小时。
[0034] 为充分反应，根据经验，当半抗原与强酸、亚硝酸钠、BSA的摩尔比为1:3:8:0. 001， 半抗原与尿素的摩尔比为1:300时搅拌反应2小时就可以，当半抗原与与强酸、亚硝酸钠、 BSA的摩尔比为1:4:10:0. 005,半抗原与尿素的摩尔比为1:320时反应就需要4小时。
[0035] 优选地，步骤B中，所述将DEP半抗原溶液加入亚硝酸钠溶液是在0~4°C低温磁 力搅拌下进行。一方面，为了后面加入蛋白质的时候不会使其变性或失活，所有需要保持蛋 白活性的长时间反应都需要在低温情况下进行，经验表明0~4°C最合适；另一方面，亚硝 酸钠加入与4-氨基邻苯二甲酸二乙酯反应生成重氮