邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工免疫原及制备、用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工免疫原DEHP-BSA及制备、用 途，具体是一种用于新兴持久性有机污染物一一塑化剂类免疫检测的邻苯二甲酸二（2-乙 基）己酯人工免疫原DEHP-BSA及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 邻苯二甲酸酯类塑化剂（缩写为PAEs)，又称酞酸酯类，是一类由邻苯二甲酸与含 有4-15个碳的醇发生费歇尔（Fischer)酯化反应所形成的酯的重要衍生物的统称。这类物 质有特殊性气味，毒性较大，一般情况下状态为粘稠液体；液态条件下温度范围宽，流动性 大，挥发性低，不溶于水，易溶于大多数有机溶剂。这类物质用途广泛，它不仅可作为食品包 装材料、玩具、农药载体、驱虫剂、润滑剂、乙烯地板和壁纸、去泡剂、清洁剂、医用材料（如 人工心脏瓣膜等人工器官、血袋、注射器和胶管）和个人护理用品（主要有化妆品、香味品、 指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液）等近千种产品的生产原材料，还常作为塑料增塑剂被 用于改造塑料制品性能。
[0003] 邻苯二甲酸二（2_乙基）己酯（英文名称：Diethylhexylphthalate，简称DEHP)， 又名酞酸双（2-乙基己）酯，CAS号为117-81-7,分子式为C24H38O4，分子量为390. 56,无色液 体，易溶于乙醇、乙醚和矿物油等。该物质强毒性，可能会造成小孩性别错乱、生殖器短小， 对动物会产生致癌反应；可在人体中累加，可危害男性生殖能力，促使女性性早熟。该物质 主要作为塑胶制品（如：软性PVC产品、医疗注射用品、玩具等）的增塑剂而广泛使用。近 些年来，中国台湾食品中检测到该物质含量较高，已对人体健康构成威胁，因此，DEHP在各 类食品中的含量引起了社会的高度关注。
[0004] 目前，关于邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯的研究主要集中在水体、沉积物、大气等 环境领域和生物体的毒性方面，但样品的检测方法方面研究较少。目前对邻苯二甲酸二 (2-乙基）己酯的检测手段主要为气相色谱和高效液相色谱等仪器检测方法，这些方法虽 然准确可靠，但对样品的预处理方法和操作人员的专业性有很高的要求。正因为这些方法 的处理复杂、耗时、仪器价格昂贵而不适合推广使用，也不利于在环境污染事故现场快速检 测。为克服这些缺点，寻求一种快速、简便、灵敏且经济实用的分析方法就成为环境监测领 域的主要研究方向。
[0005] 20世纪60年代发展起来的免疫分析（Immunoassay,IA)是基于抗原和抗体的特 异性、可逆性结合反应的分析技术。免疫分析具有常规理化分析技术无可比拟的选择性和 高灵敏性，非常适合复杂介质中痕量组分的分析。因此免疫分析具有的特异性强、灵敏度 高、方法快捷简单、分析通量大、检测成本低等优点，使得该类方法可以满足简单、快速、灵 敏地检测持久性有机污染物的要求。1971年Engvail,VanWeerman等报道了检测体液中 微量物质的固相免疫分析技术，即酶联免疫吸附分析法（enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)。目前，ELISA方法已经成为免疫分析方法中重要的组成部分。ELISA方法是 将抗原-抗体之间的免疫反应与酶的高效催化特性有机结合而发展起来的一种免疫分析 方法。其中，以亲和素-生物素信号放大系统为基础的亲和素-生物素化酶联免疫吸附分 析法，以生物素标记抗体（抗原），并以酶标亲和素代替ELISA方法中酶标抗体。亲和素是 卵白蛋白中的一种碱性糖蛋白，分子量约为68kDa。一个亲和素分子由4个亚单位组成，每 个亚单位都可以与一个生物素分子（分子量为244)特异性结合。生物素与亲和素结合特 异性强，其亲和力比抗原抗体反应大得多，亲和常数高达IO15Mi。由于一个亲和素能与4个 生物素分子结合，因此在检测中可提高被固相结合酶的数量，进而提高检测方法的灵敏度。
[0006] 目前，尚没有亲和素-生物素化酶联免疫吸附分析方法检测邻苯二甲酸二（2-乙 基）己酯的相关报道。而制备合格的邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工免疫原是建立邻苯 二甲酸二（2-乙基）己酯生物免疫分析检测方法的关键，更是建立DEHP免疫检测分析方法 的关键，这将具有重要的应用价值和理论研究意义。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种步骤简单，速度快，产率高的邻 苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工免疫原（DEHP-BSA)及制备、用途；为免疫得到特异性抗体 和利用人工抗原、抗体建立免疫检测方法奠定基础。
[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0009] 第一方面，本发明涉及一种邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯的人工免疫原DEHP-BSA， 其结构式如式（I)所示：
白。
[0011] 第二方面，本发明涉及一种邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯的人工 免疫原DEHP-BSA的制备方法，所述方法包括采用重氮化法将DEHP半抗原
腦P-BSA〇
[0012] 优选的，所述方法具体包括如下步骤：
[0013] Sl、将所述DEHP半抗原溶于非质子有机溶剂中，形成DEHP半抗原溶液；
[0014] S2、向所述DEHP半抗原溶液中依次滴加（逐滴加入，就是一滴一滴的滴入，每滴之 间没有间隔；加入速度过快容易导致重氮盐制备效率降低）强酸、亚硝酸钠溶液（IM)，控制 pH为2. 0~3. 0,反应结束后去除未反应的亚硝酸钠，生成重氮盐溶液；
[0015] S3、将牛血清蛋白BSA溶于0.01~0.05MpH9. 18 (pH过高或过低，都将影响本发 明的人工免疫原的制备）硼酸钠缓冲液中，形成牛血清蛋白溶液；
[0016]S4、在所述重氮盐溶液加入所述牛血清蛋白溶液，用强碱溶液调节pH直至溶液逐 渐呈橙红色，搅拌进行偶联反应，即得所述人工免疫原DEHP-BSA。
[0017] 本发明采用重氮化法合成邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工免疫原，其反应方程 式如下：
[0018]
[0019] 上述反应方程式中，中间产物重氮盐与牛血清蛋白BSA结合，偶联脱氯，生成了 DEHP人工免疫原。
[0020] 优选的，所述DEHP半抗原、强酸、亚硝酸钠、牛血清蛋白BSA的摩尔比为1:4~ 6:4 ~6:0. 005 ~0. 015。
[0021] 优选的，所述强酸选自浓盐酸、浓硫酸或浓硝酸；所述强碱为氢氧化钠或氢氧化 钾；所述非质子性有机溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜。
[0022] 优选的，步骤Sl中，所述去除未反应的亚硝酸钠是加入尿素以去除未反应的亚硝 酸钠，所述尿素与DEHP半抗原的摩尔比为120~180:1。
[0023] 优选的，步骤S4中，所述偶联反应是在0~4°C低温磁力搅拌下进行；所述搅拌时 间为12~24小时。所有需要保持蛋白活性的长时间反应都需要在低温情况下进行，经验 表明0~4°C最合适。此外，为充分反应，根据经验，当半抗原与强酸、亚硝酸钠、尿素、BSA 的摩尔比为1:4:4:150:0. 005时搅拌反应12小时就可以，当半抗原与与强酸、亚硝酸钠、尿 素、BSA的摩尔比为1:5:5:160:0. 008时反应就需要24小时。
[0024] 优选的，所述步骤S4还包括偶联反应结束后，离心分离，将上清液装入透析袋中 透析，离心分离沉淀即得所述人工免疫原DBP-BSA的步骤。
[0025] 优选的，所述DEHP半抗原是通过包括如下步骤的方法制备而得：
[0027] 以苯或甲苯为溶剂，所述式（II)化合物和锌粉、强酸发生还原反应，生成所述 DEHP半抗原。
[0028] 具体步骤如下：
[0029]AU将4-硝基邻苯二甲酸溶于异辛醇（又名2-乙基己醇）后再逐滴滴加强酸A形成反应液a，加热回流反应至原料点消失为止，得式（II)化合物；
[0030]A2、将所得式（II)化合物溶于非质子性有机溶剂（苯或甲苯）中形成反应液b，先 向反应液b中加入锌粉，再向反应液b中逐滴加入强酸B溶液，保持还原回流反应，至反应 完全，即得DEHP半抗原。DEHP半抗原化学名称为4-氨基邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯，分 子式：C24H39NO4，分子量：405. 57。
[0031] 优选的，所述步骤Al中，4-硝基邻苯二甲酸、异辛醇（又名2-乙基己醇）、强酸 A的摩尔比为1: (5~6) :(0.6~0.7)，反应温度为120~150°C，酯化反应时间为5~ 6小时；所述步骤A2中，式（II)化合物与强酸B、非质子性有机溶剂和锌粉的摩尔比为 1: (20~25) : (550~580) : (18~20)，其中非质子性有机溶剂作为基质溶液并不参与反 应，还原反应反应液b的温度为25~30°C，还原反应时间为10~12小时。所述强酸A、B 分别选自浓盐酸、浓硫酸或浓硝酸。
[0032] 理想状态下，4-硝基邻苯二甲酸、异辛醇的摩尔比是1:2,但为了反应顺利进行， 一般异辛醇的用量是4-硝基邻苯二甲酸的摩尔量的5倍以上，但不能超过4-硝基邻苯二 甲酸的摩尔量的6倍；此外，强酸作为酯化反应的催化剂，所用量一般是原料4-硝基邻苯 二甲酸摩尔量的0. 6倍以上，但不超过原料4-硝基邻苯二甲酸摩尔量的0. 7倍；异辛醇在 120°C处于沸腾状态，那么150°C更处于沸腾状态，反应向右进行。
[0033] 理想状态下，4-硝基邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯、强酸和纯锌粉的摩尔比是 1:10:10,为确保反应顺利向右进行，一般纯锌粉的用量是原料4-硝基邻苯二甲酸二（2-乙 基）己酯摩尔量的18倍以上，但不能超过原料4-硝基邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯摩尔 量的20倍；此外，强酸作为还原反应的强氧化剂，所用量一般是原料纯锌粉摩尔数的1倍以 上，但不超过原料纯锌粉摩尔数的1. 2倍，而非质子性有机溶剂的摩尔数需要是强氧化剂 的摩尔数的25倍以上，但不超过强氧化剂摩尔数的28倍。
[0034] 优选的，所述步骤Al还包括酯化反应完全后，蒸馏除去未反应的异辛醇和生成的 水，再趁热将液体倒入冰水中，下层的黄色油状粗品用10%Na2CO3溶液洗涤至水层呈无色， 重结晶DEHP半抗原中间体的步骤。
[0035] 优选的，所述步骤A2还包括还原反应完全后，用冰水和强碱溶液以