邻苯二甲酸二乙酯人工包被原及其制备和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及小分子有机污染物的免疫化学及生物分析技术领域，具体涉及一种邻 苯二甲酸二乙酯人工包被原及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 邻苯二甲酸酯类塑化剂（缩写为PAEs)，又称酞酸酯类，是一类由邻苯二甲酸与含 有4-15个碳的醇发生费歇尔（Fischer)酯化反应所形成的酯的重要衍生物的统称。这类物 质有特殊性气味，毒性较大，一般情况下状态为粘稠液体；液态条件下温度范围宽，流动性 大，挥发性低，不溶于水，易溶于大多数有机溶剂。这类物质用途广泛，它不仅可作为食品包 装材料、玩具、农药载体、驱虫剂、润滑剂、乙烯地板和壁纸、去泡剂、清洁剂、医用材料（如 人工心脏瓣膜等人工器官、血袋、注射器和胶管）和个人护理用品（主要有化妆品、香味品、 指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液）等近千种产品的生产原材料，还常作为塑料增塑剂被 用于改造塑料制品性能。
[0003] 其中，邻苯二甲酸二乙酯（英文名称：Diethylphthalate，简称DEP)，又名酞酸二 乙酯，CAS号为84-66-2,分子式为C12H14O4，分子量为222. 24,无色至微黄色澄清油状液体， 极易溶解于乙醇，几乎不溶于水；遇明火、高热可燃烧，具有刺激性。该物质低毒，对皮肤、 眼睛、上呼吸道有刺激作用；经皮肤吸收或摄入后可引起头痛、头晕和呕吐；具潜在的光毒 性、轻度致敏；对女性子宫有影响，可能导致胎儿畸形或死亡 ]。由于它能与大多数树脂的相 容性比较好，因此，它主要作为树脂的增塑剂而广泛应用；此外，还可作为润滑剂、起泡剂、 香水及药用包衣材料的辅料。近些年来，有研究学者发现该物质在食品（如：酒、饮料等） 中的含量过高从而危及食品安全，因此便备受人们关注。
[0004] 目前，关于DEP的研究主要集中在水体、沉积物、大气等环境领域和生物体的毒性 方面，但样品的检测方法方面研究较少。目前对邻苯二甲酸二乙酯的检测手段主要为气相 色谱和高效液相色谱等仪器检测方法，这些方法虽然准确可靠，但对样品的预处理方法和 操作人员的专业性有很高的要求。正因为这些方法的处理复杂、耗时、仪器价格昂贵而不适 合推广使用，也不利于在环境污染事故现场快速检测。为克服这些缺点，寻求一种快速、简 便、灵敏且经济实用的分析方法就成为环境监测领域的主要研究方向。因此，开展研究并建 立有效、可靠的塑化剂的检测方法及标准，并通过相关的法规予以保障，成为一项极为重要 和迫切的工作。
[0005] 20世纪60年代发展起来的免疫分析（Immunoassay,IA)是基于抗原和抗体的特 异性、可逆性结合反应的分析技术。免疫分析具有常规理化分析技术无可比拟的选择性和 高灵敏性，非常适合复杂介质中痕量组分的分析。因此免疫分析具有的特异性强、灵敏度 高、方法快捷简单、分析通量大、检测成本低等优点，使得该类方法可以满足简单、快速、灵 敏地检测持久性有机污染物的要求。1971年Engvail,VanWeerman等报道了检测体液中 微量物质的固相免疫分析技术，即酶联免疫吸附分析法（enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)。目前，ELISA方法已经成为免疫分析方法中重要的组成部分。ELISA方法是 将抗原-抗体之间的免疫反应与酶的高效催化特性有机结合而发展起来的一种免疫分析 方法。其中，以亲和素-生物素信号放大系统为基础的亲和素-生物素化酶联免疫吸附分 析法，以生物素标记抗体（抗原），并以酶标亲和素代替ELISA方法中酶标抗体。亲和素是 卵白蛋白中的一种碱性糖蛋白，分子量约为68kDa。一个亲和素分子由4个亚单位组成，每 个亚单位都可以与一个生物素分子（分子量为244)特异性结合。生物素与亲和素结合特 异性强，其亲和力比抗原抗体反应大得多，亲和常数高达1015M1。由于一个亲和素能与4个 生物素分子结合，因此在检测中可提高被固相结合酶的数量，进而提高检测方法的灵敏度。
[0006] 现有技术中，一篇名为"环境激素邻苯二甲酸二甲酯（二乙酯）的荧光免疫分析新 方法研究"的硕士论文中公开了一种邻苯二甲酸二乙酯的荧光免疫分析方法，但该方法中 包被原和免疫原采用相同的制备方法，这样易引起假阳性反应，从而限制了该免疫分析方 法的灵敏度的进一步提尚。
[0007]目前尚没有亲和素-生物素化酶联免疫吸附分析法检测邻苯二甲酸二乙酯的相 关报道。而制备合格的邻苯二甲酸二乙酯人工包被原是建立邻苯二甲酸二乙酯生物免疫分 析检测方法的关键，更是建立DEP免疫检测分析方法的关键，这将具有重要的应用价值和 理论研究意义。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种步骤简单，速度快，产率高的邻 苯二甲酸二乙酯人工包被原（DEP-OVA)的制备和用途；本发明制备的塑化剂邻苯二甲酸二 乙酯人工包被原（DEP-OVA)为利用包被原、高特异性的多克隆抗体建立亲和素-生物素化 酶联免疫吸附分析法奠定基础。
[0009] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0010] 本发明提供了一种邻苯二甲酸二乙酯人工包被原，其结构式如式（I)所示：
[0011]
[0012] 本发明还提供了一种邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的制备方法，所述方法包括：
卵清白蛋白OVA偶联反应，即得邻苯二甲酸二乙酯人工包被原。
[0014] 优选地，所述采用戊二醛法将邻苯二甲酸二乙酯半抗原与卵清白蛋白OVA偶联反 应具体包括以下步骤：
[0015] 将邻苯二甲酸二乙酯半抗原溶解于非质子性有机溶剂a形成的邻苯二甲酸二乙 酯半抗原溶液加入到卵清白蛋白溶液中形成反应液；
[0016] 向所述反应液中加入戊二醛，搅拌反应。
[0017] 优选地，所述非质子性有机溶剂a为N，N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜；所述卵清白 蛋白溶液是将卵清白蛋白溶解于磷酸缓冲液中制备得到；所述搅拌反应是在O~4°c冰浴 遮光条件下进行的，反应时间为20~28h。所有需要保持蛋白活性的长时间反应都需要在 低温情况下进行，经验表明0~4°C最合适。
[0018] 优选地，所述邻苯二甲酸二乙酯半抗原、戊二醛和卵清白蛋白的摩尔比为1:4~ 6:0. 005 ~0. 02。
[0019] 为充分反应，根据经验，当半抗原与戊二醛、OVA反应的摩尔比是1:6:0. 005时搅 拌反应20小时就可以，当半抗原与戊二醛、OVA反应的摩尔比是1:4:0. 02时反应就需要28 小时。
[0020] 优选地，所述采用戊二醛法将邻苯二甲酸二乙酯半抗原与卵清白蛋白OVA偶联反 应具体还包括反应结束后，将反应液进行离心分离得上清液，将上清液装入透析袋中透析， 离心分离沉淀后，得纯化后的邻苯二甲酸二乙酯人工包被原DEP-0VA。
[0021] 优选地，所述邻苯二甲酸二乙酯半抗原的制备包括如下步骤：
与乙醇发生酯化反应，生成4-硝基邻苯二甲酸二乙酯；
[0023]S2、在非质子性有机溶剂存在的条件下，所述4-硝基邻苯二甲酸二乙酯和锌粉、 强酸b发生还原反应，生成邻苯二甲酸二乙酯半抗原，S卩DEP半抗原，化学名称为4-氨基邻 苯二甲酸二乙酯，分子式：C12H15NO4，分子量：237. 25。
[0024] 优选地，步骤Sl中，4-硝基邻苯二甲酸、乙醇、强酸性介质a的摩尔比为1:5~ 7:0. 6~0. 8 ;酯化反应温度为86~90°C，时间为8~10小时；所述强酸性介质a选自浓 盐酸、浓硫酸或浓硝酸。
[0025] 优选地，步骤S2中，所述4-硝基邻苯二甲酸二乙酯与强酸b、非质子性有机溶剂和 锌粉的摩尔比为1: (550~580) : (20~22) : (18~20)(其中苯作为基质溶液并不参与反 应），所述强酸b选自浓盐酸、浓硫酸或浓硝酸；还原反应的温度为25~35°C，时间为10~ 12小时。
[0026] 优选地，所述非质子有机溶剂为苯或甲苯。
[0027] 优选地，所述锌粉为纯锌粉，即化学级别分析纯，国药试剂公司生产。
[0028] 优选的，步骤Sl还包括酯化反应结束后蒸馏除去未反应的乙醇和生成的水，再趁 热将液体倒入冰水中，下层的黄色油状粗品用10%Na2OV^液洗涤至水层呈无色，重结晶， 得到纯化后的4-硝基邻苯二甲酸二乙酯的步骤。
[0029] 优选的，步骤S2还包括回流反应结束后用冰水和强碱以终止反应，苯萃取反应 液，分离、干燥并减压蒸馏去除有机相，得到的粗品再用硅胶柱层析（洗脱剂为体积比为 1:8的乙酸和正己烷的混合液）纯化，得到纯化后的邻苯二甲酸二乙酯半抗原的步骤。
[0030] 本发明采用戊二醛法合成邻苯二甲酸二乙酯人工包被原，其反应方程式如下：
[0031]
[0032] 制备时，4-硝基邻苯二甲酸与乙醇在强酸的催化作用下酯化反应得邻苯二甲酸二 乙酯半抗原中间体4-硝基邻苯二甲酸二乙酯；4-硝基邻苯二甲酸二乙酯和锌粉在强酸的 作用下发生还原反应得邻苯二甲酸二乙酯半抗原；采用戊二醛法，将所述半抗原与卵清白 蛋白偶联反应，即得包被原DEP-0VA。上述反应方程式中，戊二醛一端的醛基与邻苯二甲酸 二乙酯半抗原4-氨基邻苯二甲酸二乙酯的氨基结合，戊二醛另一端的醛基与卵清白蛋白 OVA-端的氨基结合，偶联脱水，生成了DEP人工包被原。
[0033] 本发明还提供了一种邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的用途，用于邻苯二甲酸二乙 酯的检测。
[0034] 优选的，所述检测采用亲和素-生物素化酶联免疫吸附分析法，检测时所述邻苯 二甲酸二乙酯人工包被原与被分析物邻苯二甲酸二乙酯直接竞争具特异性免疫反应的抗 邻苯二甲酸二乙酯特异性抗体。
[0035] 由于邻苯二甲酸二乙酯人工包被原（DEP-OVA)可以与被分析物邻苯二甲酸二乙 酯形成直接竞争关系，它们都能特异性识别抗邻苯二甲酸二乙酯的多克隆抗体，进而建立 专一、高效的生物免疫方法用于水体、土壤、大