鼠Bpifb5基因多克隆抗体及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本申请涉及一种鼠Bpifb5基因多克隆抗体及其制备方法。
【背景技术】
[0002] Bpifb5基因是一个新基因，研究表明，其在小鼠精子发生过程中具有一定的功能 作用，因此，有必要对其进行更进一步的研究。
【发明内容】
[0003] 本发明提供一种新的鼠Bpifb5基因多克隆抗体及其制备方法。
[0004] 本发明提供一种鼠Bpifb5基因多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
[0005] a)用PCR方法扩增序列如SEQIDNO: 1所示的Bpifb5基因和序列如SEQIDNO: 2 所示的pET32a表达质粒；
[0006] b)将Bpifb5基因连接到pET32a表达载体中构建重组质粒；
[0007] c)将所述重组质粒转入BL21感受态细菌，经过培养、诱导、裂解和纯化，得到特异 性目的蛋白；
[0008] d)免疫兔子后，采血，纯化抗体血清，得到多克隆抗体。
[0009] 所述步骤a)中，PCR扩增时，基因Bpifb5上游引物如SEQIDN0:3所示，基因 Bpifb5下游引物如SEQIDN0:4所示；质粒pET32a上游引物如SEQIDN0:5所示，质粒 pET32a下游引物如SEQIDN0:6所示。
[0010] 所述步骤C)中，培养时，将含有所述重组质粒的菌液加入到高压灭菌的无抗生素 LB培养基中，并加入氨苄抗生素。
[0011] 所述步骤c)中，通过IPTG诱导。
[0012] 所述步骤c)中，利用裂解液进行裂解，所述裂解液包括TrisHCl、NaCl和EDTA。
[0013] 所述步骤c)中，所述纯化包括包涵体蛋白处理和梯度透析。
[0014] 一种鼠Bpifb5基因多克隆抗体，所述抗体识别的蛋白序列如SEQIDNO: 7所示。
[0015] 本发明的有益效果是：通过制备基因Bpifb5的多克隆抗体，该抗体能够特异性识 别目的蛋白，从而便于研究目的蛋白的表达和定位等。
【附图说明】
[0016] 图1是Bpifb5克隆鉴定图；
[0017] 图2是SDS-PAGE表达分析图；
[0018] 图3是表达蛋白的westernblot鉴定图；
[0019] 图4是小鼠睾丸免疫组化图；
[0020] 图5是空白对照图。
【具体实施方式】
[0021] 下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0022] 在一种实施方式中，鼠Bpifb5基因多克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
[0023]a)用PCR方法扩增序列如SEQIDNO: 1所示的Bpifb5基因和序列如SEQIDNO: 2 所示的pET32a表达质粒；其中，Bpifb5基因序列是现有序列，其登录信息是：NM_144890,该 基因的蛋白序列如SEQIDN0:8所示，其登录号是：NP_659139。
[0024]b)将Bpifb5基因连接到pET32a表达载体中构建重组质粒；连接时，可以采用T4 连接酶。
[0025]c)将所述重组质粒转入BL21感受态细菌，经过培养、诱导、裂解和纯化，得到特异 性目的蛋白。
[0026] d)免疫兔子后，采血，纯化抗体血清，得到多克隆抗体。
[0027] 如图1至图5所示，在另一种实施方式中，鼠Bpifb5基因多克隆抗体的制备方法 包括如下步骤：
[0028] 1、通过不依赖连接酶的克隆方法（LIC)重组质粒
[0029]a)设计质粒pET32a以及基因Bpifb5mRNA的引物，引物如表1所示：
[0030] 表1质粒pET32a和基因Bpifb5的合成引物
[0031]
[0032]
[0033]b)通过PCR的方法扩增目的片段Bpifb5和表达质粒pET32a(采用TAKARA公司的 PrimeSTARGXLDNAPolymerase)，GXL高保真PCR反应体系如表 2 所不：
[0034] 表2 :PCR反应体系
[0035]
[0036]PCR反应条件是：1. 98°C5min;2、98°CIOsec;3、6(TC15sec;4、68°C17min;5、2 ~ 4 循环 30 次；6、6(TCIOmin;7、12°C0/N(overnight，过夜）。
[0037]PCR反应体系中，dNTPMixture为dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合溶液，每种的浓 度均为2. 5mM。
[0038]c)通过胶纯化试剂盒纯化所得Bpifb5片段和pET32a表达载体。
[0039]d)T4DNA连接酶（TAKARAT4DNAPolymerase2040A)处理pET32a表达载体和Bpifb5 片段。
[0040]dl)每20ul反应液加入0? 037pmol的pET32a表达载体；
[0041]d2)每20ul反应液加入0. 12-0. 48pmol的胶回收纯化产物；
[0042]d3)用T4连接酶处理pET32a表达载体与Bpifb5片段，其反应体系如表3所示；
[0043] 表3T4连接酶处理时的反应体系
[0044]
[0045]
[0046]d4)在 22°C条件下孵育 30min;
[0047]d5) 75°C孵育20min以灭活T4连接酶。
[0048] e)表达载体与目的片段连接
[0049] el)将样品（表达载体和目的片段的混合液）离心处理；
[0050]e2)根据表达载体与目的片段的所得的浓度将两者以1:1的拷贝数混合于一管；
[0051]e3)22°C孵育 5min;
[0052]e4)力卩 2. 5EDTA(25mM)(SIGMAEDS-100G)并混匀；
[0053]e5)22°C孵育 5min;
[0054]e6)将所构建的重组质粒转入BL21感受态细菌。
[0055] 2、表达融合蛋白pET32a_Bpifb5
[0056]a)挑选转化后的单克隆于5MLLB培养基中，37°C，280rpm培养箱摇菌16h。
[0057]b)用500ML锥形瓶装入100mL的无抗生素LB培养基，高压灭菌。
[0058]c)将含有重组质粒的Iml菌液加入到高压灭菌的无抗生素LB培养基中，加入 IOOul浓度lOOug/ml的氨苄抗生素。
[0059] d) 37°C，280rpm摇菌两小时45分钟后，检测其OD595~0? 6。
[0060]e)冰上冷却15分钟。
[0061] f)加入IPTG(原浓度 24mg/ml，终浓度 1/100)。（TAKARA9030)
[0062] g)37°C，280rpm摇菌三小时。
[0063]h) 12000rpm，4°C，离心 30min。收集沉菌，称净重。
[0064]i)每Ig加入 2 ~5mlbufferW(K)OMmTrisHClph8.0,IOOmMNaCl，ImMEDTA)，吹 打混匀，于功率17%~20%超声破碎，至悬液澄清为宜。
[0065] j)12000rpm，4°C，离心lOmin。收集上清液以及沉淀。
[0066] 3、包涵体蛋白处理：
[0067]a)配置8M的尿素（融于1XPBS)冰上预冷。
[0068]b)将超声破碎后的沉菌融于8M尿素中，吹打混匀，4°C垂直旋转8h~0/N。
[0069] c) 4°C，12000rcf离心15min，收集上清，上清即为可溶蛋白。
[0070]d)用两倍体积的8M尿素加IOmM咪唑溶解可溶蛋白，加入预先准备的带特定标签 的beadz〇
[0071] 6)4。〇摇晃1~211。
[0072]f)1000 Orcf离心lOmin。
[0073]g)用预装柱收集beadz。
[0074] h)用8M尿素配制300mM咪唑，将吸附在beadz的目的蛋白洗脱下来。
[0075] 4、梯度透析：
[0076]a)用IXPBS分别配制 7]?、61、51、4]\121、01尿素，预冷。
[0077] b)组装半透膜透析袋，将目的蛋白密封在透析袋中，分别从高浓度的尿素到底浓 度的尿素进行透析，每一个浓度透析4~6h。
[0078]c)回收蛋白溶液，用超滤管进行超滤浓缩。
[0079]d)最后将浓缩蛋白-80 C保持，以备后续实验使用。
[0080] 上述梯度透析和包涵体蛋白处理都用于纯化蛋白。
[0081] 5、获取特异性目的蛋白，皮下注射入兔子体内。
[0082]a)配制1 ? 5mmSDS-PAGE蛋白胶若干块。
[0083]b)将蛋白溶液进行SDS-PAGE跑胶分析。
[0084]c)配制 2MKC1500ml，冰上孵育。
[0085]d)将蛋白胶完全浸泡入预先准备好的冰镇KCL溶液，摇床摇晃5min后，既能看到 在目的条带大小附近有特异的白色条带出现。确定为目的条带后将其切割，收集于4ml的 离心管中。
[0086]e)用400~500ulIXPBS溶解，搅拌器或匀浆器将切割下来的蛋白胶研磨成浆。
[0087]f)收集浆液。
[0088]g)用三通管注射器将浆液与佐剂以1:1的比例混匀。以见乳白色混匀液为宜。
[0089]h)充分混匀后，收集混合液，注射入兔子体内。每次2ml，每周一次，持续1. 5个月。
[0090]i)两个月后，抽取兔子耳静脉血。室温过夜。提取血清即为该目的蛋白的多克隆 抗体。该兔子为新西兰大白兔。
[0091]j)用western blot进行抗体鉴定。
[0092] 如图1所示，1~6为重组质粒pET32a_Bpifb5转化后选择的六个单克隆的PCR鉴 定，表明所选的单克隆PCR鉴定结果全部正确。
[0093] 如图2所示，F2、F3均为Bpifb5表达蛋白SDS-PAGE蛋白胶鉴定结果，在53KD左 右有特异的目的条带，证明蛋白被成功的表达纯化。
[0094] 如图3所示，其是以纯化蛋白为样本，免疫血清为抗体的westernblot结果。实验 证明，该血清作为抗体能够特异性的识别目的蛋白。表明该抗体特异性好。
[0095] 如图4所示，其为应用本实施方式抗体在小鼠睾丸组织中进行免疫组化的结果， 该抗体在小鼠睾丸生精小管中有表达，区域A为特异结合范围。图5是空白对照图。
[0096] 以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
【主权项】
1. 一种鼠Bpifb5基因多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： a) 用PCR方法扩增序列如SEQ ID NO: 1所示的Bpifb5基因和序列如SEQ ID NO: 2所示 的pET32a表达质粒； b) 将Bpifb5基因连接到pET32a表达载体中构建重组质粒； c) 将所述重组质粒转化到BL21感受态细菌中，经过培养、诱导、裂解和纯化，得到特异 性目的蛋白； d) 免疫兔子后，采血，纯化抗体血清，得到多克隆抗体。2. 如权利要求1所述的鼠Bpifb5基因多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤 a)中，PCR扩增时，基因Bpifb5上游引物如SEQ ID NO: 3所示，基因Bpifb5下游引物如SEQ ID N0:4所示；质粒pET32a上游引物如SEQ ID N0:5所示，质粒pET32a下游引物如SEQ ID N0:6所示。3. 如权利要求1所述的鼠Bpifb5基因多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤 c)中，培养时，将含有所述重组质粒的菌液加入到高压灭菌的无抗生素LB培养基中，并加 入氨苄抗生素。4. 如权利要求1所述的鼠Bpifb5基因多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤 c)中，通过IPTG诱导。5. 如权利要求1所述的鼠Bpifb5基因多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤 c)中，利用裂解液进行裂解，所述裂解液包括Tris HCl、NaCl和EDTA。6. 如权利要求1所述的鼠Bpifb5基因多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤 c)中，所述纯化包括包涵体蛋白处理和梯度透析。7. -种鼠Bpifb5基因多克隆抗体，其特征在于，所述抗体识别的蛋白序列如SEQ ID NO:7所示。
【专利摘要】本发明公开了一种鼠Bpifb5基因多克隆抗体及其制备方法，包括步骤：a)用PCR方法扩增序列如SEQ？ID？NO:1所示的Bpifb5基因和序列如SEQ？ID？NO:2所示的pET32a表达质粒；b)将Bpifb5基因连接到pET32a表达载体中构建重组质粒；c)将所述重组质粒转入BL21感受态细菌，经过培养、诱导、裂解和纯化，得到特异性目的蛋白；d)免疫兔子后，采血，纯化抗体血清，得到多克隆抗体。通过制备基因Bpifb5的多克隆抗体，该抗体能够特异性识别目的蛋白，从而便于研究目的蛋白的表达和定位等。
【IPC分类】C07K16/18, C12N15/70, C07K16/06
【公开号】CN105085674
【申请号】CN201410203420
【发明人】黄卫人, 吴汉伟, 牟丽莎, 刁瑞英, 桂耀庭, 蔡志明
【申请人】深圳市第二人民医院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月14日