抗vegfr2人源纳米抗体ntv1及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药领域。更具体地，本发明涉及一种VEGFR2纳米抗体、该抗体 的制备方法以及该抗体在制备抗癌症药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一，截止2012 年，全世界有超过820万人死于癌症，世界卫生组织和各国政府卫生部门都把攻克癌症列 为一项首要任务。但是肿瘤的治疗仍然是当今医学界的难题，研究人员一直在寻找肿瘤治 疗的新方向。通过研究肿瘤发现，血管生成是肿瘤发生、发展的必要条件，而血管内皮生长 因子受体（vascularendothelialgrowthfactorreceptor,VEGFR)作为血管生成关键因 子VEGF的受体也成为抗肿瘤药物的靶向的研究热点。
[0003]肿瘤血管为肿瘤的生长提供了充足的营养供给，同时也促进了癌细胞的扩散和转 移。VEGF是主要作用于血管内皮细胞的生长因子，具有促进内皮细胞增殖、增加微血管通 透性、诱导血管生成等多种功能。已有研究证实VEGF的高表达与实体肿瘤的形成及其转 移、风湿性关节炎、牛皮癣、糖尿病性视网膜病变、动脉硬化等疾病有着密切关系。VEGF通过 与血管内皮细胞膜上的特异性受体VEGFR结合来激活信号传导。VEGFR家族的成员包括： VEGFRl、VEGFR2和VEGFR3。它们均为跨膜蛋白，由胞外的7个免疫球蛋白样的功能域、胞内 的酪氨酸激酶功能域和中间的一段跨膜序列组成。其中VEGFR2定位于人4qll_12,由1356 个氨基酸构成，可促进血管内皮细胞增殖、迁移及增加毛细血管通透性。研究已经证实，肿 瘤血管内皮细胞的有丝分裂与肿瘤微血管的渗透性主要是通过VEGF与VEGFR2的相互作用 而发生的。VEGFR2在健康的成人身体内表达水平很低甚至不表达；而在许多肿瘤中，例如 乳腺癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、宫颈癌、肝细胞癌、成血管细胞瘤、脑胶质瘤等的肿瘤血管内 皮细胞中是高表达的。另外，VEGFR2胞外区部分缺失实验证实：VEGF主要是通过与VEGFR2 胞外的I-III区特异性结合来发生信号传导的。
[0004] 自从Kohler和Milstein发明杂交瘤技术制备单克隆抗体以来的几十年中，抗体 已被广泛应用于临床疾病的诊断和治疗。目前治疗性单克隆抗体药物已经成为生物制药中 增长最快的领域，单抗药物以靶向性强、疗效明确、副作用小等优势在自身免疫性疾病、癌 症等领域应用广泛。其中，抗肿瘤血管生成抗体具有靶向性、特异性、专一性等特性，能特异 性阻断肿瘤血管的发生发展，降低对其他组织的杀伤作用。目前用于临床的抗肿瘤血管生 成的抗体药物贝伐单抗（bevacizumab，Avastin)于2004年被美国FDA批准用于非小细胞 肺癌的治疗，并在其他肿瘤的治疗中表现出良好的疗效。然而，由于其对VEGFRl和VEGFR3 的也有抑制作用，全面阻断了VEGF介导的相关信号通路，导致患者出现高血压、鼻出血、蛋 白尿等严重不良反应。骆驼体内天然存在缺失轻链的重链抗体，其可变区是最小的功能性 抗原结合片段。一般来说，这类抗体的相对分子质量为15KDa，仅为常规抗体的1/10,其分 子高度为4. 8nm，直径为2. 2nm，故称为纳米抗体（nanobody)。纳米抗体作为最小的功能性 抗原结合片段，独特的生物学结构特征赋予了它们许多优势，如稳定性强、可溶性好、免疫 原性低、容易表达等等。纳米抗体含有3个互补决定区（complementaritydetermining regions，⑶Rs)。从纳米抗体的立体结构发现，较长的⑶R3与相邻的⑶Rl或⑶R2由二硫 键连接成环来稳定构象。传统抗体Fab片段及单链抗体ScFv抗体的抗原结合区形成凹形 的或平面结构，只能识别位于抗原表面的位点，而重链抗体的CDR3较长，可形成稳定的大 凸环结构，深入具有裂缝凹陷结构的抗原内部，例如酶的活性位点、病毒与宿主细胞结合位 点等。因此纳米抗体具有更加广泛的抗原结合力。其次，纳米抗体的CDRl区和骨架区存在 半胱氨酸残基（Cys)，可以和CDR3区中的Cys残基形成二硫桥，增加了可变区的稳定性和结 构变化。另外，纳米抗体具有分子量小、穿透力较强并且可以制备成多功能抗体或者携带化 药等特点，使得这类抗体在对实体瘤和需要穿过血脑屏障疾病的治疗中具有显著优势。除 此之外，随机突变及噬菌体展示等技术的引入也使得纳米抗体文库的构建及特异性纳米抗 体的筛选过程变得更加便捷、高效。VEGFR2是最重要的药物靶点之一，具有广阔的研发前景 和重要的现实意义。然而，传统抗体亲和力成熟、蛋白表达纯化和生物效应的技术瓶颈严重 的限制了VEGFR2抗体药物的研发。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明的目的之一是提供一种具有高亲和力和良好抗肿 瘤活性的、高效、毒副作用低且易于生产的抗VEGFR2人源纳米抗体。
[0006] 本发明另一方面的目的是提供一种制备上述抗体的方法。
[0007] 本发明又一方面的目的是提供上述抗体在制备用于治疗抗肿瘤药物中的用途。
[0008] 为了实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：
[0009] 本发明提供一种抗VEGFR2人源纳米抗体，包括框架区和互补决定区，其特征在 于，所述纳米抗体具有SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列。
[0010] 本发明还提供一种制备抗VEGFR2纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0011] a.采用噬菌体展示技术筛选出与VEGFR2结合的纳米抗体，并通过基因比对分析， 挑选出重复最高的序列；
[0012] b.将上一步筛选出的纳米抗体重新构建于表达载体中，并采用原核细胞表达系统 表达，获得商纯度蛋白；以及
[0013] c.采用AlphaScreen技术从上一步筛选出的纳米抗体中进一步筛选出的亲和力 最1?的抗体。
[0014] 下面对上述步骤进行更详细的描述。
[0015]a.采用噬菌体展示技术筛选与VEGFR2结合的纳米抗体
[0016] 优选地，首先采用生物淘选技术筛选阳性噬菌体，并将阳性克隆在宿主菌TGl中 扩增富集；然后进行阳性克隆DNA序列测定、基因比对分析，从中挑选出重复最高的序列。[0017] 更优选地，首先采用液相淘选技术将抗原固定在磁珠表面，加入含有人源纳米抗 体库的结合液中，筛选阳性噬菌体，并将阳性克隆在宿主菌TGl中扩增富集，优选地，所述 扩增进行4轮；然后在最后两轮淘选中随机挑选阳性克隆进行基因测序及基因比对分析， 从中挑选出重复次数最高的序列。
[0018]b.纳米抗体的表达纯化
[0019] 优选地，将挑选出的序列应用NotI和BamHI限制性内切酶及DNA重组技术将酶 切后的PCR扩增产物插入携带6His-sum〇标签的酶切线性化的pET载体中，构建表达质粒； 将质粒转化至宿主菌中培养至对数期，诱导表达；收集细菌沉淀，超声法充分裂解细菌，取 上清，为粗提蛋白；粗提蛋白经过镍亲和柱及分子筛柱，得到纯化蛋白样品；用电泳检测目 的蛋白的表达，对出现频率较高的克隆进行原核系统表达纯化。
[0020] c.纳米抗体亲和力筛选优选地，采用AlphaScreen技术测定抗原和抗体间的相互 作用，进一步筛选出的亲和力最高的抗体。
[0021] 本发明还提供以上所述的抗VEGFR2人源纳米抗体在制备用于抗癌症药物中的用 途。
[0022] 其中，所述癌症包括乳腺癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、宫颈癌、肝细胞癌、成血管细胞 瘤、脑胶质瘤。
[0023] 本发明人通过深入研究VEGFR2乃至整个VEGFRs受体家族配体识别和受体活化的 机制，首次采用噬菌体展示技术筛选出富集人源化纳米抗体并对其进行基因测序及蛋白表 达纯化；进一步通过AlphaScreen技术筛选出与抗原具有较高结合力的纳米抗体；得到了 具有更高亲和力和良好抗肿瘤活性的人源纳米抗体NTVl。通过表面等离子共振（SPR)技术 表征该抗体的动力学行为；细胞实验验证了其抑制血管内皮细胞增殖能力及抑制血管新生 活性。本发明表达并优化获得亲和力高且稳定均一的VEGFR2纳米抗体蛋白，成功研发人源 抗VEGFR2纳米抗体药物，开辟了靶向VEGFR2抗体的药物研发的新领域，具有深远的社会意 义和广阔的临床应用前景。并且，本发明为相关后续药物研发提供了基础，可以据此研发携 带化药或者融合Fc的抗体以增加疗效。
【附图说明】
[0024] 图1:显示NTV(1-4)四种纳米抗体氨基酸序列比对。将抗体的基因序列翻译成氨 基酸序列，进行多序列比对。未标记的是互补决定区，标记的是框架区。
[0025] 图2:显示NTV(l-4)蛋白的表达纯化。10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白纯度， 标准分子量标在凝胶左侧。从左到右分别为NTVl、NTV2、NTV3、NTV4。
[0026]图 3=AlphaScreen检测VEGFR2D3 和NTV(1-4)之间的反应。（A)AlphaScreen反 应示意图，（B_E)NTV1、NTV2、NTV3、NTV4 与VEGFR2D3 反应的AlphaScreen检测结果。图 4: SPR分析NTVl和VEGFR2D3反应动力学。
[0027] 图5 :NTV1对人脐静脉细胞增殖的效应。
[0028] 图6 :NTV1体外抑制HUVEC血管形成效应。
【具体实施方式】
[0029] 以下实施例和实验例所用实验仪器和实验材料信息如下：
[0030] 试剂及试剂盒
[0031] 质粒小提试剂盒 百泰克
[0032]PCR产物回收试剂盒 百泰克
[0033] 琼脂糖凝胶回收试剂盒 百泰克
[0034] 琼脂糖生工
[0035]蛋白胨sigma
[0036] 酵母提取物sigma
[0037]Tris-basesigma
[0038]生物素 sigma
[0039]咪唑 sigma
[0040]内切酶BamHlNEB
[0041]内切酶NotlNEB
[0042]T4DNA连接酶Fermentas
[0043]Q5~HighFidelityDNApolymeraseNEB
[0044]麦芽糖 sigma
[0045]嗤菌体展不库HuSdLTMCreativeBioLabs
[0046]辅助嗤菌体M13K07helperphageGEHealthcare
[0047]磁珠DyiUlbeads拉MyOne?StreptavidinCllifetechnologies
[0048]IPTG 生工
[0049]PEG8000 sigma
[0050]SDSsigma
[0051]Tween-20 国药
[0052]BiotinCAPtureKitSeriesSGEHealthcare
[0053]AlphascreenHistidineDetectionKitPerkinElmer
[0054] 仪器设备
[0055]AKTAFPLC系统（GE)
[0056]NanoVuespectrophotometer(GE)
[0057]centrifuges5415R(Eppendorf)
[0058]SorvallRC12BPcentrifuge(Thermo)
[0059]avantiJ-26xp(BECKMANCOULTER)
[0060]Incubator/shakerfor2Lbacterialcultures(Thermo)
[0061] 层析冷柜（北京德天佑）
[0062]PCR machines(Eppendorf)
[006