Pcsk9靶向重组疫苗设计及其应用

文档序号:9365826阅读:615来源:国知局
Pcsk9靶向重组疫苗设计及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域,具体地说,本发明涉及PCSK9靶向重组疫苗设计及其 应用。
【背景技术】
[0002] 动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是由脂肪、血栓、结缔组织和碳酸f丐在血管 (主要是动脉)沉积所造成的一种对人体有害的状态,可导致患者发生心肌缺血、心肌梗 死、脑卒中风及外周血管疾病等心脑血管疾病,严重影响了人类健康和生活质量。目前由动 脉粥样硬化导致的心血管疾病(CVD)在发达国家人口死亡原因中领先癌症居于首位。虽然 近年来随着医疗技术的发展,CVD死亡率呈下降趋势,但是数据显示CVD仍然是发达地区的 首要死亡原因。据统计在2005年每10万美国人有278. 9人因CVD致死。值得重视的是, 近年来随着中国社会经济的发展人民生活水平的提高饮食结构的改变及人口老龄化的出 现心脑血管疾病的发病率和病死率也呈上升趋势并且发病年龄有年轻化的趋势。
[0003] AS形成的过程复杂,致病危险因素很多,到目前还未确立明确的理论学说,但是 研究表明,高胆固醇血症是导致AS的重要危险因素之一,早在1962年,Dawber等在对 Framingham地区高胆固醇血症长达几十年的大样本研究中即发现,高胆固醇血症与动脉粥 样硬化(AS)和冠心病的发病率和死亡率呈显著的正相关。近年的REVERSAL、4S、PR0VE-IT、 IDEAL等大型临床研究的结果也都证实了高胆固醇血症与AS和冠心病之间的因果关系。此 外,在AS诸多危险因素中,高胆固醇血症是唯一在缺乏其他危险因素协同条件下,能够独 立诱发和推进人类和实验动物中动脉粥样硬化发生发展的因素。
[0004] 高胆固醇血症,是指机体内胆固醇过高而导致的疾病。胆固醇是人体脂类物质的 主要成分之一,它是构成细胞膜,生成胆汁酸,合成类固醇激素等物质的原材料,是维持人 体健康必不可少的重要物质。血液中胆固醇和其他血浆脂质(除脂肪酸外)一样,是以与 载脂蛋白形成复合物的形式存在。为了使不溶于水的胆固醇能够在血液中运输,需要与蛋 白质相结合,形成脂蛋白从而溶于血液中。血液中脂蛋白经过超高速离心根据密度不同主 要分为三类,分别为高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)。 虽然已知胆固醇在机体内有着广泛的生理作用,但并不是越多越好,而是存在着最适浓度 范围,如果血浆中胆固醇的含量特别高、引起低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)过高时,就会 导致高胆固醇血症,这时会对人体产生非常不利的影响。日常生活中,当机体血脂发生异 常而未并发其它疾病时一般没有什么明显的症状,因此不引起重视,往往是在体检或其它 检查时发现的,血脂指标主要看血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平(表1)。当TC,LDL-C水平异常增高而TG正 常,即为高胆固醇血症。
[0005] 机体的胆固醇含量与饮食和自身胆固醇合成与代谢能力有关。在日常生活中大部 分人能够通过合理饮食,坚持体育锻炼,减少饮酒和吸烟等手段能够有效的控制胆固醇水 平,但是对于高血脂的中老年人、原发性高胆固醇血症患者、脂代谢异常、血脂高的冠心病 人等胆固醇水平超标(>260mg/dL)的人,需要在控制饮食和锻炼的基础,利用药物进行调 控。目前临床应用的降血脂药主要有他汀类、贝特类、烟酸类、胆酸鳌合剂类等。
[0006] 在这些众多降脂药物中,目前他汀类药物治疗效果最好,应用也最为广泛,但是这 些药物的使用也会产生一定不良反应,例如他汀类大剂量服用会产生肌毒和升高肝转氨 酶,贝特类和烟酸类药物可能会产生胃肠道不适、肝肾损伤等。而且部分病人对于他汀类药 物不耐受,更重要是大部分胆固醇高危和极度高危患者,例如严重原发性血脂障碍(例如 家族性高胆固醇血症;家族联合性高脂血症或P脂蛋白异常)患者;基础LDL-C水平非常 高的患者;极高CVD风险、需要强化治疗的患者;由于潜在严重药物相互作用、合并症或不 能耐受高剂量他汀类药物,而导致的他汀类药物剂量受限的患者等,现有药物治疗均未能 达到LDL-C目标值。所以多种药物联合使用和新作用靶点的药物的研究和开发成为近年来 降胆固醇药物研究的主要方向。而在新作用靶点药物研究方面,前蛋白转换酶枯草溶菌素 9 (Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9)是非常有医疗应用前景的 调节血脂的药物作用靶点。
[0007] 因此,本领域技术人员致力于针对PCSK9的免疫作用靶点,研究针对PCSK9靶点的 药物。

【发明内容】

[0008] 本发明的目的在于提供一种PCSK9靶向重组疫苗及其应用。
[0009] 本发明的第一方面,提供了一种抗原表位肽,所述抗原表位肽源自哺乳动物(如 人)的PCSK9蛋白且包含一个或多个抗原表位,
[0010] 并且所述抗原表位肽氨基酸序列长度为相应的PCSK9蛋白全长的1-100% (优选 地,所述抗原表位肽氨基酸序列长度为相应的低免疫原性蛋白全长的1-70% ;更优选地,所 述抗原表位肽氨基酸序列长度为相应的低免疫原性蛋白全长的1-50% ;最优选地,所述抗 原表位肽氨基酸序列长度为相应的低免疫原性蛋白全长的1-44%,如1%、1.5%、44% ), 且所述抗原表位肽的长度为8-692个氨基酸;
[0011] 并且所述抗原表位肽与载体蛋白形成的重组蛋白可诱发同一种类的所述哺乳动 物产生针对PCSK9蛋白的免疫反应。
[0012] 在另一优选例中,所述抗原表位源自PCSK9,并且选自下组:
[0013] (I)SEQ ID NO. :6、8、10所示的氨基酸序列;
[0014] (2)将SEQ ID NO. :6、8、10所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取 代、缺失或添加而形成的,且与载体蛋白融合后具有诱发针对PCSK9免疫反应功能的衍生 多肽。
[0015] 本发明的第二方面,提供了一种融合蛋白,所述融合蛋白是如本发明第一方面所 述的抗原表位肽与载体蛋白融合所形成的。
[0016] 在另一优选例中,所述载体蛋白与所述抗原肽段不是来自同一个蛋白,所述载体 蛋白包含至少一个T细胞表位,所述载体蛋白可以增强所述表位肽的免疫原性。
[0017] 在另一优选例中,所述载体蛋白包括白喉毒素DT、白喉毒素的跨膜结构域DTT、轮 状病毒VP7、利什曼原虫的热休克蛋白、空肠弯曲菌鞭毛蛋白、沙眼衣原体主要外膜蛋白、血 蓝蛋白(KeyholeLimpetHemocyanin,KLH)、牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin,BSA), 鸡卵白蛋白(Ovalbumin,OVA),纤维蛋白原。
[0018] 在另一优选例中,在所述载体蛋白的至少一个分子表面氨基酸残基区通过拼接、 替换和/或插入引入所述抗原表位肽形成所述融合蛋白。
[0019] 在另一优选例中,所述"分子表面氨基酸残基区"包括loop区、beta-tum区、N末 端或C末端。
[0020] 在另一优选例中,所述抗原表位肽连接于所述载体蛋白的C末端和/或N末端形 成所述融合蛋白。
[0021 ] 在另一优选例中,所述抗原表位肽连接于所述白喉毒素的跨膜结构域DTT载体蛋 白的C末端形成所述融合蛋白。
[0022] 在另一优选例中,所述抗原表位和所述载体蛋白之间具有连接肽。优选地,所述连 接肽长度为3-30个氨基酸。更优选地,所述连接肽长度为4-20个氨基酸。最优选地,所述 连接肽长度为7-17个氨基酸。
[0023] 在另一优选例中,所述抗原表位和所述载体蛋白之间不具有连接肽。
[0024] 在另一优选例中,所述融合蛋白选自:
[0025] (a)具有SEQIDNO. : 14、16、或18所示氨基酸序列的多肽;
[0026] (b)将(a)中多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的,且与 载体蛋白融合后具有诱发针对PCSK9免疫反应功能的衍生多肽。
[0027] 本发明的第三方面,提供了一种分离的多核苷酸,所述的多核苷酸编码本发明第 一方面的抗原表位或第二方面所述的融合蛋白。
[0028] 在另一优选例中,所述多核苷酸选自下组:
[0029] (a)编码如SEQIDNO. :6、8、或10所示多肽的多核苷酸;
[0030] (b)序列如SEQIDNO. : 5、7、或9所示的多核苷酸;
[0031] (c)核苷酸序列与SEQIDNO. :5、7、或9所示序列的同源性彡95% (较佳地 彡98% )的多核苷酸;
[0032] (d)如SEQIDNO. : 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较 佳地1-30,更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸;
[0033] (e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
[0034] 在另一优选例中,所述多核苷酸选自下组:
[0035] (a)编码如SEQIDNO. : 14、16、或18所示多肽的多核苷酸;
[0036] (b)序列如SEQIDNO. : 13、15、或17所示的多核苷酸;
[0037] (c)核苷酸序列与SEQIDNO. :13、15、或17所示序列的同源性彡95% (较佳地 彡98% )的多核苷酸;
[0038] (d)如SEQIDNO. : 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较 佳地1-30,更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸;
[0039] (e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
[0040] 本发明的第四方面,提供了一种表达载体,所述表达载体含有本发明第三方面所 述的多核苷酸。
[0041] 本发明的第五方面,提供了一种宿主细胞,所述的宿主细胞含有本发明第四方面 所述的表达载体,或者在基因组中整合有本发明第三方面所述的多核苷酸。
[0042] 在另一优选例中,所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
[0043] 在另一优选例中,所述的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、CHO细胞、DC细胞等。
[0044] 本发明的第六方面,提供了一种药物组合物,所述的组合物含有本发明第一方面 所述的抗原表位肽、第二方面所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的多核苷酸或者本发 明第四方面所述的表达载体或者本发明第五方面所述的宿主细胞,以及药学上可接受的载 体和/或辅料。
[0045] 在另一优选例中,所述的组合物为疫苗。
[0046] 本发明的第七方面,提供了一种疫苗组合物,所述的组合物含有本发明第一方面 所述的抗原表位肽、第二方面所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的多核苷酸或者本发 明第四方面所述的表达载体或者本发明第五方面所述的宿主细胞,以及免疫学上可接受的 载体和/或辅料。
[0047] 在另一优选例中,所述的疫苗组合物还含有佐剂。
[0048] 在另一优选例中,所述疫苗组合物为核酸疫苗组合物,所述核酸疫苗组合物中包 含本发明第三方面所述的多核苷酸或者本发明第四方面所述的表达载体
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