一种螺旋体糊精槲皮素包合物及其制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及变性淀粉的生产方法，具体是指利用生物酶技术和添加诱导剂相结合制备螺旋体糊精槲皮素包合物的方法。
【背景技术】
[0002]槲皮素是在植物界中大量存在的一种黄酮类化合物，是黄酮类化合物中的重要一员，属于黄酮醇类化合物，在植物中多以糖苷的形式存在于许多植物的花、叶、果实中，如芦丁、槲皮甙、金丝桃甙等。槲皮素及其衍生物具有如抗氧化和清除氧自由基、降低血压、保护心肌缺血、避免缺血再灌注损伤、增强免疫功能及抗癌、抗菌、抗病毒、镇痛，抗心律失常、扩张血管、抗肿瘤等作用，并且其对人体无毒、无害、无致癌、无致死、无致畸等优点，国外曾试用于多种疾病的治疗，并取得了良好的效果。因此近年来，对槲皮素及其衍生物的合成和药理活性研究备受关注。但天然的槲皮素因含有五个极性较大的羟基基团，亲酯性与亲水性都较弱，存在强烈的首过效应、生物利用度极低、临床治疗方面应用局限性强，使其在工业中的应用受到了很大的限制。
[0003]螺旋体糊精是一种由D-吡喃葡萄糖单元通过α -1，4糖苷键连接而成的轻度分支或线形多糖，呈右手螺旋结构，在螺旋内部只含氢原子，是亲油性的，羟基位于螺旋外侧。在适当条件下，螺旋体糊精分子可与无机或有机的分子络合，形成螺旋状内络物。螺旋体糊精和环糊精具有一个共同的性质，即均能作为一种主体分子与各种客体分子发生包结络合作用形成包结络合物，客体分子可位于螺旋空腔内部，也可位于两个螺旋之间。但是现有技术用于研究螺旋体糊精包结络合功能所用的螺旋体糊精多为从原淀粉中分离得到，成本较高，不利于螺旋体糊精包结络合体的工业化生产和应用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种生产成本低、生物活性高的螺旋体糊精槲皮素包合物及其制备方法，以改善槲皮素的使用特性和应用范围。
[0005]本发明采用脱支酶对淀粉进行脱支，得到大量的螺旋体糊精分子。通过普鲁兰脱支酶限制性酶解可控制螺旋体糊精的分子量和聚合度得到适于进行包结络合作用的螺旋体糊精。加入螺旋空腔诱导剂可促进螺旋体糊精单螺旋结构的形成同时又增大其空腔尺寸，进而提高螺旋体糊精的包结络合能力。目前国内关于利用脱支酶酶解作用制备螺旋体糊精并加入α-萘酚诱导剂制备螺旋体糊精包结络合载体的方法还未见报道。本发明螺旋体糊精通过疏水相互作用与槲皮素包结络合，达到改善槲皮素溶解性及生物利用性低的缺点。本发明制备的螺旋体糊精槲皮素包结络合物，槲皮素包结在螺旋体糊精的螺旋空腔内，添加诱导剂后槲皮素与螺旋体糊精的结合更加紧密。
[0006]本发明的目的通过如下技术方案实现:
[0007]—种螺旋体糊精槲皮素包合物的制备方法，包括如下步骤:
[0008]I)淀粉原料配成淀粉乳，在65?75°C下搅拌糊化；糊化完成后，将糊化液冷却，调节pH值至4.5?6.0，加入脱支酶，用量为每克干淀粉加入脱支酶10?30u，在55?65°C下搅拌反应2?5小时；调节温度至90-99°C，并保持10?30分钟，灭酶，加入用无水乙醇配制的α -萘酚溶液，恒温搅拌10?30分钟，得螺旋体糊精溶液；
[0009]2)将所得螺旋体糊精溶液的温度调节至30?80°C，滴加溶有质量百分比为10?20%的槲皮素冰醋酸溶液，恒温搅拌反应I?6小时，每克干淀粉加入槲皮素冰醋酸溶液
0.25?0.5g ;冷却至室温后冷藏；
[0010]3)将步骤(2)的产品离心、洗涤、干燥、粉碎后得黄色粉末状产品。
[0011]为了更好的实现本发明，优选地，所述淀粉原料为木薯淀粉、马铃薯淀粉、小麦淀粉、蜡质玉米淀粉、蜡质小麦淀粉或玉米淀粉。
[0012]优选地，所述脱支酶为普鲁兰酶。
[0013]优选地，所述α -萘酸的浓度为1.0?3.0mg/mL，用量为每克干淀粉加入α -萘酸溶液2.0?6.0mL0
[0014]优选地，所述淀粉原料配成淀粉乳是淀粉原料用NaOH溶液配成淀粉乳；所述的质量百分比浓度为8%?20% ;所述NaOH溶液的pH值为8_9。
[0015]优选地，所述糊化的时间为20?30分钟。
[0016]优选地，所述冷藏为放入4°C冰箱中冷藏18?36小时。
[0017]优选地，所述洗涤为用去离子水洗涤多次，直至溶液中无残留冰醋酸。
[0018]—种螺旋体糊精槲皮素包合物，由上述制备方法制得；每克螺旋体糊精槲皮素包合物中槲皮素的含量为32-40毫克，包合率为79-84%。
[0019]本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果:
[0020](I)采用生物酶解及添加诱导剂的技术对淀粉原料进行改性，得到具有良好包结络合功能的螺旋体糊精，将其应用于包结络合槲皮素；经测定发现，淀粉经酶解及添加诱导剂处理后，制备得到的螺旋体糊精槲皮素包合物，每克包合物中槲皮素的含量为32-40毫克，包合率为79-84%，并且槲皮素的生物活性也得到改善，扩大了槲皮素应用范围。
[0021](2)本发明具有生产效率高，成本低，产品质量好的特点。
【附图说明】
[0022]图1为未包合凝沉木薯螺旋体糊精(a)和实施例1所得木薯螺旋体糊精槲皮素包合物的红外图谱(b)。
[0023]图2为未包合凝沉木薯螺旋体糊精(a)和实施例1所得木薯螺旋体糊精槲皮素包合物的X-射线衍射图谱(b)。
【具体实施方式】
[0024]为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地说明。本发明有许多成功的实施例，下面列举六个具体的实施例，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
[0025]实施例1
[0026]第一步木薯淀粉(30g，干基)用pH为8.0的NaOH溶液配成质量百分比浓度为15%的淀粉乳，置于三口烧瓶中在70°C下搅拌糊化25分钟；完成后，将糊液冷却，调节pH至4.5，加入普鲁兰酶(OPTIMAXL-1000，杰能科生物工程有限公司)，用量为每克干淀粉加入普鲁兰酶10u，在60°C下搅拌反应4小时；调节温度至99°C并保持20分钟灭酶，加入用无水乙醇配制的α -萘酚溶液，控制α -萘酚浓度为1.5mg/mL，用量为每克干淀粉加入α -萘酚溶液4.0mL，恒温搅拌15分钟，得木薯螺旋体糊精溶液；
[0027]第二步将步骤(I)所得木薯螺旋体糊精溶液的温度调节至60°C，将溶有质量百分比为10%的槲皮素冰醋酸溶液15g滴加入上述溶液中，恒温搅拌反应4小时；冷却至室温后，放入4°C冰箱中冷藏18小时；
[0028]第三步将步骤(2)的产品离心、洗涤、干燥、粉碎后得淡黄色粉末状产品。得到的产品通过紫外分光光度法测定表明，每克产品中槲皮素的含量为39.75毫克，包合率达到84.11%。通过荧光淬灭实验对该产品的抗氧化性能进行测定，结果表明由添加α-萘酚诱导剂的螺旋体糊精槲皮素包合物产品，其氧自由基清除能力为116.2 ymolTrolox/g，与未添加诱导剂的包合物(氧自由基清除能力为98.2 ymolTrolox/g)相比，氧自由基清除能力明显增强。
[0029]有关槲皮素的含量，包合率，抗氧化性能的测试方法说明如下:
[0030]紫外分光光度法是测定槲皮素含量的常用方法，具体测定方法为:精密称取绝干的包合物12.5mg，加60%无水乙醇使其溶解，用60%无水乙醇定容至50mL，用分光光度计在373nm波长下测其吸光度值，取三次测量的平均值，对照槲皮素的标准曲线，计算包合物中槲皮素的含量及包合率。槲皮素含量的计算方法如下:
[0031]包合物样品中的槲皮素含量公式..X= (C1XyiXN)Z(In0XlOOO);其中:X为每克样品中的槲皮素含量mg/g，C1为从标准曲线上确定的样品液中的槲皮素含量mg/mL，V i为样品总体积mL，N为定容后的稀释倍数，m。为样品质量g。
[0032]包合物样品中的槲皮素包合率公式:Y= (Ih1XXX 100% )/(m2X 1000);其中:Y为槲皮素包合率％，Hi1为得到包合物的质量g，X为每克样品中槲皮素的含量mg/g，m2为反应时加入槲皮素的质量g。
[0033]当螺旋体糊精中包结络合的槲皮素达到一定量时，通过红外光谱可测得其结构的变化，主要表现为在1715cm 1左右出现一个新的槲皮素羰基吸收峰(如图1)。螺旋体糊精包结络合有机物形成包合物后，其结晶结构通常为典型的V型，由图2可知，与未包合的凝沉螺旋体糊精的B型结晶结构不同，本发明所得包结络合产品，其结晶结构为明显的V型。
[0034]氧自由基清除能力是衡量槲皮素抗氧化性能大小的重要指标。荧光淬灭实验是测定抗氧化性能的常用实验方法。
[0035]具体方法为:在96孔荧光板各微孔中加入待测样品20 μ L(将Trolox用相应的缓冲液做适当的稀释)，接着加入75mmol/L磷酸盐缓冲液和70nmol/LFL各20 μ L，并将微孔板置于酶标仪中，在37°C下孵化15min后，用多道移液器迅速在各孔中加入12mmol/LAAPH140 μ L启动反应，在37°C以激发波长485nm，发射波长520nm，每2min测定一次各微孔的荧光强度，测定时间设在荧光衰减呈基线后为止，即设为2h，并计算样品ORAC值。
[0036]实施例2
[0037]第一步马铃薯淀粉(30g，干基)用pH为8.0的NaOH溶液配成质量百分比浓度为10%的淀粉乳，置于三口烧瓶中在65°C下搅拌糊化30分钟；完成后，将糊液冷却，调节pH至5.0，加入普鲁兰酶(OPTIMAXL-1000，杰能科生物工程有限公司)，用量为每克干淀粉加入普鲁兰酶15u，在55°C下搅拌反应5小时；调节温度至95°C并保持15分钟灭酶，加入用无水乙醇配制的α -萘酚溶液，控制α -萘酚浓度为1.0mg/mL，用量为每克干淀粉加入α -萘酚溶液6.0mL,恒温搅拌10分钟，制得马铃薯螺旋体糊精溶液；
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