一种溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物制剂技术领域，具体涉及一种溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆 菌制剂的工业化液体一固体复合发酵方法。
【背景技术】
[0002] 随着水产养殖业迅猛发展，养殖水体富营养化日益加剧，导致蓝藻大量繁殖，蓝藻 水华高频率爆发（曹煜成等，2007)。蓝藻会大量耗氧且能释放蓝藻毒素，败坏水质，造成 水生动物中毒死亡，对水环境和养殖效益造成巨大影响（彭聪聪等，2011)。有研究表明， 利用溶藻菌可特异性地抑制有害微藻，达到优化水体微藻群落的效果（王祥荣等，2010)。 当前该领域的研究热点还主要为针对海洋赤潮和湖沼水华的有害微藻种类的特性与治理 等方面，YANG等筛选了溶解赤潮中肋骨条藻（Skeletonemaostatum)的溶藻菌SK-5(YANG etal，2013)，THEERASAK等筛选了杀灭引起蓝藻水华的铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa)的放线菌（THEERASAKetal，2013)，但有关运用溶藻菌抑制池塘水体有害微 藻的研究少见报道（TEEYAPORNetal，2012)。
[0003] 池塘环境与开放性水体的环境差异巨大，在微藻优势种群结构、水体营养水平、人 工技术措施等方面的差别致使针对开放性水域的相关研究无法直接借鉴到养殖生产应用 中。对此，曹煜成等选用筛得的一株池塘蓝藻溶藻菌一錯样芽孢杆菌（Bacilluscereus) CZBCl(曹煜成等，ZL201310203745. 3)，蜡样芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，广泛存在于环境中， 目前已被应用于医药、农业生产等领域（李煜等，2012;李侠等，2001)。阳钢等通过向水体 泼洒蜡样芽孢杆菌BC-I有效提高了刺参的生长速度（阳钢，2012)，何鉴尧等筛得两株蜡样 芽孢杆菌L7和L8对螺旋鞘丝藻均有显著地控制效果（何鉴尧，2008)。曹煜成等筛得的蜡 样芽孢杆菌CZBCl经实验室生态学试验证实，其具有适应广温、广盐、耐高pH和低耗氧的特 性，可以通过直接或间接机制溶解浮游颤藻、绿色颤藻、小颤藻等有害蓝藻，具有良好的颤 藻溶解专一性，对其他优良绿藻和硅藻等无溶解效应，并且对养殖对虾也无不良影响，适宜 池塘水产养殖生产应用（曹煜成，2014)。
[0004] 目前针对蜡样芽孢杆菌CZBCl菌剂的工业化液体一固体复合发酵生产方法还未 见报道。虽然有学者就蜡样芽孢杆菌发酵工艺、溶藻菌发酵条件优化等进行过报道（王海 云等，一株蜡样芽胞杆菌及其制备方法、应用，申请号201410223612. 7 ;朱杰等，芽孢杆菌 属溶藻菌的固体发酵与应用，申请号201210308126. 6 ;孙梅等，一种巨大芽孢杆菌及其固 体发酵制备菌剂的方法和应用，申请号201310413693. 2;荣小军等，一种蜡样芽孢杆菌及 其制剂和应用，申请号201010602326. 3;叶姜瑜等，响应曲面法优化溶藻细菌发酵条件的 研究，2011 ;许珂等，溶藻细菌W5培养条件优化及发酵培养），但其中研究的溶藻菌并非上 述蜡样芽孢杆菌，并且蜡样芽孢杆菌也不是所有菌株都具有溶藻特性的，加之有不少有关 溶藻菌发酵研究的报道多为研究性质，仍未达到菌剂的工业化发酵生产的需求，也未见相 关菌剂的工业化生产产品。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液 体一固体复合发酵方法，该方法确实了液体发酵和固体发酵的工艺参数，一方面保证该方 法可满足蜡样芽孢杆菌制剂产品的工业化液体一固体发酵生产需求，另一方面保证形成的 蜡样芽孢杆菌制剂产品并未因工业化和规模化的生产致使其溶藻特性和生长特性受到影 响，仍具有良好的颤藻溶解专一性，对优良绿藻和硅藻无溶解效应，对养殖对虾也无不良影 响，菌剂产品可用于养殖生产应用。
[0006] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种溶解养殖池塘颤藻的蜡样 芽孢杆菌制剂的工业化液体一固体复合发酵方法，包括以下步骤：
[0007] (1)确定蜡样芽孢杆菌CZBCl液体发酵的液体培养基和固体发酵的固体培养基；
[0008] (2)菌种活化培养：将保种的蜡样芽孢杆菌CZBCl菌种进行活化培养；
[0009] (3)扩大培养：将活化好的蜡样芽孢杆菌CZBCl菌种进行扩大培养，得种子液；
[0010] (4)液体发酵：将种子液接种到装有步骤（1)中确定的液体培养基中进行液体发 酵培养至芽孢数量达到10 1°个AiL以上，得液体发酵后的种子液；
[0011] (5)固体发酵：将步骤（4)获得的液体发酵后的种子液接种至步骤（1)中确定的 固体培养基中进行固体发酵培养至芽孢数量达到IO9个/g以上，且芽孢获得率达到90%以 上，得固体发酵物；
[0012] (6)干燥、粉碎和包装：将步骤（5)获得的固体发酵物经包括干燥、粉碎和包装工 序处理后，即制得溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂。
[0013] 在上述溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体一固体复合发酵方 法中：
[0014] 步骤（1)中确定的蜡样芽孢杆菌CZBCl液体发酵的液体培养基为在IL水中包括 葡萄糖8~10g、玉米淀粉8~10g、酵母膏12~15g、氯化钠4~7g，pH为7. 2~7. 5。
[0015] 步骤⑴中确定的蜡样芽孢杆菌CZBCl固体发酵的固体培养基由以下质量份配比 的原料制成：麸皮58~70、豆柏18~25、玉米淀粉2. 3~3. 5、葡萄糖0. 8~1. 0、酵母粉 L2~L5、磷酸二氢钾0? 15~0? 25、硫酸镁0? 04~0? 06、碳酸钙L5~2. 0,pH为7. 2~ 7. 8〇
[0016] 步骤（2)中将保种的蜡样芽孢杆菌CZBCl菌种进行活化培养时，培养基为营养肉 汤固体培养基，营养肉汤固体培养基的pH为6. 50~7. 20, 28~30°C活化培养18~24h。
[0017] 步骤（3)中将活化好的蜡样芽孢杆菌CZBCl菌种进行扩大培养时，培养基为营养 肉汤液体培养基，营养肉汤液体培养基的pH值为6. 50~7. 20, 28~30°C恒温振荡培养 18 ~24h，转速为 180 ~230rpm。
[0018] 步骤⑷中液体发酵培养时间为18~28h，温度28~30°C。
[0019] 进一步的：步骤（4)中液体发酵包括：采用500L的发酵罐系统进行液体发酵，以 发酵罐容积60~65%的装液量在配料池中配置液体培养基，开启锅炉对发酵罐及管路进 行灭菌操作（121°C，20min)，再冷却至接种温度，将实验室显微镜检查合格的摇瓶种子液， 接种到500L的发酵罐培养18~28h，取样进行实验室显微镜检查，确认菌种未受杂菌污染， 且数量达到IOwCfuAiL以上，将发酵好的种子液注入与处理好的固体发酵培养基充分混合 均匀。
[0020] 步骤（5)中固体发酵培养采用压力脉动固态发酵反应器，压力脉动发酵的参数 为：充压2. 5~3. 5min，谷压0? 03~0? 04MPa，维持9~llmin，峰压0? 25~0? 30MPa维持 19~21min，发酵时间为26~30h，发酵温度为28~30°C。
[0021] 进一步的，步骤（5)中固体发酵包括：配置2吨固体发酵培养基，固体培养基经 搅拌机充分搅拌均匀后，以传送带送入蒸煮罐121°C高温蒸煮消毒30min，待冷却至室温后 将经液体发酵的种子液接入其中，通过传送带分装至各发酵盘上，分装的厚度控制在30~ 65cm左右，然后将发酵盘置于20吨的压力脉动式固体反应器进行发酵，发酵过程中以鼓 风控温方式，将发酵温度保持与28~30°C左右，压力脉动发酵的参数为：充压3min，谷压 0. 03MPa，维持lOmin，峰压0. 25MPa维持20min。持续稳定发酵26~30h，取样检查，保证发 酵物中的菌种纯化，芽孢数量达到IO9个/g以上，芽孢获得率达到90%以上。
[0022] 步骤（6)中干燥采用流化床干燥，将固体发酵物置于流化床65~70°C烘干至水分 10%以下。
[0023] 步骤（6)中粉碎时粉碎机的孔径为60~100目。
[0024] 步骤(6)中包装采用防潮铝箱袋进行真空密封包装。
[0025] 本发明最好对制成的蜡样芽孢杆菌制剂进行质量抽检，产品质量抽检包括：从最 终形成的真空包装的溶藻蜡样芽孢杆菌制剂产品中，按1%左右的比例抽取样品检测产品 的纯度、芽孢形态与数量。并在实验室测试菌体于水体环境的复活情况，以及对养殖水体 中颤藻等有害蓝藻的溶藻效果。确保菌株未因工业化的生产流程影响其生长性能和溶藻特 性。抽检结果显示：菌剂产品菌量达到IO9个/g以上，置于颤藻水体中能有效杀灭和抑制 颤藻生长，5~7d内使藻数量至少降低30%以上。
[0026] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0027] (1)本发明方法实现了对优选水产养殖池塘蓝藻溶藻菌一一蜡样芽孢杆菌CZBCl 的工业化液体一固体复合发酵生产，建立了本菌剂从菌种到产品的工业化规模生产的相关 工艺；
[0028] (2)本发明方法实行液体一固体复合发酵培养，针对生产过程各个阶段实行多层 次抽样监测，