一种细胞培养液及其应用以及诱导牙髓干细胞向神经样细胞分化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及一种细胞培养液及其应用以及诱导牙 髓干细胞向神经样细胞分化的方法。
【背景技术】
[0002] 许多临床上常见的慢性神经系统退化疾病，如：帕金森氏综合征、阿尔茨海默症、 亨丁顿氏症及肌萎缩性脊髓侧索硬化症。这些疾病都是由于中枢神经系统中的神经细胞退 化及死亡造成的。另外，外部创伤也会造成的神经损伤，导致严重的行为功能障碍。
[0003] 神经细胞不会像表皮及肝脏细胞那样快速的再生。虽然，中枢神经系统中的干细 胞也可复制及分化，但其复制速度极慢，分化成神经细胞的比例也非常低，大部分会分化成 为神经胶质细胞，不能治疗神经退化疾病或外部创伤造成的神经损伤。
[0004] 神经细胞的移植提供了一个治疗神经退化疾病或神经损伤的新的方向，研究表 明，骨髓干细胞能够在体外经诱导分化为尾申鲸胶质细胞及大神经胶质细胞。另有研究表 明，将胚胎干细胞移植如体内后能够分化为星细胞或寡树突细胞，极少数转变为神经细胞。 但是，胚胎干细胞或骨髓干细胞，不仅取得困难，移植后的生存率也不高，分化为神经细胞 的比例就更低。胚胎干细胞的移植还收到宗教、道德和法律的限制。
[0005] 牙髓间充质干细胞（DentalPulpStemCell，DPSCs)是来源于神经嵴的多能干细 胞，与骨髓间充质干细胞（bonemarrowstromalcells，BMSCs)相比较，两者在人类4400 个基因表达水平上是一致的，包括表达细胞外基质成分、细胞粘附分子、生长因子、转录调 节因子等基因，并且具有相似的免疫表型，在形态上也很类似，但牙髓间充质干细胞与骨髓 中提取的干细胞相比有明显的优势：⑴来源广泛，易于采集（乳牙自然脱落、智齿的拔除 等）；（2)自体应用，安全健康，且不产生免疫排斥反应；(3)分化能力和可塑性更强，可分化 为更多种类的组织细胞；(4)具有更强的增殖能力和自我更新能力。体外研究发现，DPSCs 是来源于神经嵴和间充质的多潜能干细胞，在特定的诱导条件下可分化为神经样细胞，但 是现有技术中，将DPSCs诱导为神经细胞周期较长，分化效率较低。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种细胞培养液及其应用以及诱导 牙髓干细胞向神经样细胞分化的方法。本发明提供的细胞培养液能够用于诱导牙髓干细胞 分化为神经样细胞。采用该培养液诱导DPSCs向神经样细胞分化周期短，分化效率高。
[0007] 本发明提供的细胞培养液，包括基础培养液、⑶NF、Shh、EGF和cAMP。
[0008] 在本发明的实施例中，⑶NF、Shh、EGF和cAMP的质量比为（50~100) :(80~120): (10 ~100) : (10 ~100) 〇
[0009] 在一些实施例中，⑶NF、Shh、EGF和cAMP的质量比为75:10:55:55。
[0010] 在一些实施例中，⑶NF、Shh、EGF和cAMP的质量比为70:105:50:60。
[0011] 在一些实施例中，⑶NF、Shh、EGF和cAMP的质量比为80:110:60:50。
[0012] 在一些实施例中，⑶NF、Shh、EGF和cAMP的质量比为50:80:10:100。
[0013] 在一些实施例中，⑶NF、Shh、EGF和cAMP的质量比为100 :120:100:10。
[0014] 在本发明的实施例中，⑶NF的浓度为50ng/mL~lOOng/mL;Shh的浓度为80ng/ mL~120ng/mL;EGF的浓度为 10ng/mL~100ng/mL;cAMP的浓度为 10ng/mL~100ng/mL。
[0015] 胶质细胞系衍生的神经营养因子（glialcell-derivedneurotrophicfactor， GDNF)，对多巴胺能神经样、运动神经样、感觉神经样等多种神经样均具有营养及损伤后修 护作用，是一种重要的生物活性营养因子，参与神经细胞程序化死亡、促进神经样存活、参 与轴突损伤的修复及促进pukinje细胞的分化、发育。
[0016] 音猬因子（Sonichedgehog，Shh)，是胚胎发育过程中由脊索产生的一种因子，作 为一种重要的调控因子Shh参与了调控了神经系统的发育和分化过程。当前研究表明Shh 信号途径在胚胎干细胞分化为神经系统的过程中是必须的。音猬因子可以诱导干细胞生成 运动神经样和少突胶质细胞，提高骨髓间充质干细胞分泌神经营养因子，促进神经样的存 活和促进轴突的生长，阻碍星形胶质细胞的生成。
[0017]腺苷-3'，5'-环化一磷酸（CyclicAdenosinemonophosphate，cAMP)，参与调节 细胞的许多代谢过程，其影响激素的合成和分泌。并且，cAMP参与神经节突触传递，在神经 组织中起重要作用。
[0018] 表皮细胞生长因子（epidermalgrowthfactor，EGF)能促进上皮细胞、成纤维细 胞的增值；增强表皮细胞的活力；延缓表皮细胞的老化。
[0019] 本发明将⑶NF、Shh、EGF和cAMP添加入基础培养基，从而提高DPSCs向神经样细 胞分化的百分率。实验表明，添加⑶NF、Shh、EGF和cAMP的实验组中，DPSCs形态在12小 时开始发生改变；而在诱导24小时后，DPSCs形态发生明显变化，细胞折光性开始增强，突 起增多增长，分化为神经样细胞形态。经westernbolt检测，诱导24h后，DPSCs中Nestin 和MAP2的表达量显著提高。
[0020] 在本发明的实施例中，基础培养液为DMEM/F12无血清培养液。
[0021] 本发明所用的基础培养液可为自制也可为购买获得，本发明对此不做限定，其实 施皆在本发明的保护范围之内。本发明采用的人干细胞无血清培养基为DMEM/F12无血清 培养液。。本发明采用的基础培养液皆不含有异源血清，降低了动物源血清给人体带来的风 险。
[0022] 本发明以⑶NF、Shh、EGF和cAMP作为诱导因子，以DMEM/F12无血清培养液作为基 础培养液。实验表明，采用本发明提供的细胞培养液诱导DPSCs向神经样细胞分化的效果 优于现有技术。
[0023] 本发明提供的细胞培养液在诱导牙髓干细胞向神经样细胞分化中的应用。
[0024] 本发明还提供了诱导牙髓干细胞向神经样细胞分化的方法，包括以下步骤：
[0025] 步骤1:牙髓干细胞以基础培养基培养至贴壁后，以EGF预诱导；
[0026] 步骤2 :将经预诱导的细胞以本发明提供的细胞培养液诱导。
[0027] 在一些实施例中，基础培养基为DMEM/F12无血清培养液。
[0028] 在一些实施例中，步骤1中牙髓干细胞以基础培养基培养的接种密度为2XIO3个 /cm2。
[0029] 在一些实施例中，步骤1所述培养的时间为4h~6h。
[0030] 在一些实施例中，步骤1所述培养的条件为5%C02、37°C、湿度95%。
[0031] 在本发明的实施例中，预诱导所用EGF的浓度为lOng/mL~100ng/mL。
[0032] 在一些实施例中，预诱导所使用EGF的浓度为20ng/mL。
[0033] 在一些实施例中，预诱导的条件为5 %C02、37°C、湿度95%。
[0034] 在本发明的实施例中，预诱导的时间为12h~36h。
[0035] 在一些实施例中，预诱导的时间为24h。
[0036] 在本发明的实施例中，预诱导后，弃除培养基，以PBS清洗细胞2次后，以本发明提 供的细胞培养液诱导。
[0037] 在一些实施例中，步骤2所述诱导的条件为5 %C02、37°C、湿度95%。
[0038] 在本发明的实施例中，步骤2所述诱导的时间为12h~36h。
[0039] 在一些实施例中，步骤2所述诱导的时间为24h。
[0040] 在本发明的实施例中，牙髓干细胞为3~5代的牙髓干细胞。
[0041] 在一些实施例中，牙髓干细胞的制备方法为：将牙髓组织以I型胶原酶消化后，用 无血清培养基培养，培养24小时后换液，然后每2~3天换液一次，培养至贴壁细胞汇合度 达80% -90%后，传代。
[0042] 在一些实施例中，I型胶原酶的质量分数为0. 3%。
[0043] 在一些实施例中，消化的时间为30min。
[0044] 在一些实施例中，传代具体为：以质量分数为0. 25 %的胰蛋白酶消化细胞后，按 照0. 8XIO4个/cm2的密度传代培养。
[0045] 以本发明提供的方法制备的牙髓干细胞传代3次后，纯度不低于98%。
[0046] 本发明提供了一种细胞培养液及其应用以及诱导牙髓干细胞向神经样细胞分化 的方法。本发明提供的细胞培养液中包括基础培养液、⑶NF、Shh、EGF和cAMP。本发明提供 的培养液能够用于诱导牙髓干细胞分化为神经样细胞。采用该培养液诱导DPSCs，DPSCs形 态在12小时开始发生改变；而在诱导24小时后，DPSCs形态发生明显变化，细胞折光性开 始增强，突起增多增长，分化为神经样细胞形态。经westernbolt检测，诱导24h后，DPSCs 中Nestin和MAP2的表达量显著提高。因此，本